EVALUACIÓN IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE HOJAS
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Agronomía Costarricense 45(2): 9-27. ISSN:0377-9424 / 2021
www.mag.go.cr/rev agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr
EVALUACIÓN IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE HOJAS
DE BORRAJA (Borago officinalis) CONTRA LA ACTIVIDAD FUNGISTÁTICA
Juan Esteban Villota-Burbano1/*, Olga Yaneth Vazquez-Ochoa2
Palabras clave: Fusarium sp; Alternaria sp; ITS; metabolitos secundarios; maleza.
Keywords: Fusarium sp; Alternaria sp; ITS; secondary metabolites; weed.
Recibido: 15/05/2020 Aceptado: 21/09/2020
RESUMEN ABSTRACT
Introducción. Fusarium sp y Alternaria In vitro evaluation of ethanol extract
sp son hongos fitopatógenos que causan serios from borraja leaves (Borago officinalis) against
problemas en cultivos y en el sector agríco- fungistatic activity. Introduction. Fusarium sp
la, situación que genera pérdidas económicas and Alternaria sp are phytopathogenic fungi
importantes. Además, debido a la producción that cause serious problems in crops and in
de micotoxinas representan una amenaza para the agricultural sector, situation that generates
la salud de los consumidores y para las plantas. significant economic losses. In addition, due to
Objetivo. Evaluar la actividad antifúngica del the production of mycotoxins, they pose a threat
extracto etanólico de hojas de borraja (Borago to the health of consumers and plants. Objective.
officinalis) sobre Fusarium sp y Alternaria sp. To evaluate the antifungal activity of the ethanolic
Materiales y métodos. Se realizó la identifica- extract of borraja leaves (Borago officinalis)
ción cualitativa y cuantitativa de los metabolitos on Fusarium sp and Alternaria sp. Materials
secundarios presentes en el extracto etanólico and methods. Qualitative and quantitative
de B. officinalis, posteriormente, Fusarium sp y identification of the secondary metabolites
Alternaria sp. fueron secuenciadas por estudios present in the ethanolic extract of B. officinalis
moleculares mediante la amplificación de la was carried out, later, Fusarium sp and Alternaria
región ITS (espaciador transcribible interno) del sp were sequenced by molecular studies by
ADN ribosomal y finalmente, se evaluó la acti- amplifying the ITS (internal transcribable spacer)
vidad antifúngica del extracto sobre las cepas region of ribosomal DNA and finally, antifungal
previamente reconocidas mediante la prueba activity of the extract on previously recognized
de crecimiento radial por técnica de difusión strains was evaluated by means of radial growth
en agar. Resultados. El extracto etanólico de test using agar diffusion technique. Results.
las hojas de B. officinalis contiene alcaloides, Ethanolic extract of B. officinalis leaves contains
* Autor para correspondencia. Correo electrónico: 2 Universidad Central, Facultad de Ingeniería
Jvillotab@ucentral.edu.co y Ciencias Básicas, Semillero de Biotecnología
1 Universidad Central, Facultad de Ingeniería y ambiental, Bogotá, Colombia.
Ciencias Básicas, Semillero de Biotecnología iD 0000-0002-3595-8177.
ambiental, Bogotá, Colombia.
iD 0000-0002-1554-3628.
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flavonoides, fenoles, polifenoles y saponinas, alkaloids, flavonoids, phenols, polyphenols and
de los cuales los polifenoles y los flavonoides saponins, of which polyphenols and flavonoids
presentan una concentración de 19,08±0,01 mili- have a concentration of 19.08±0.01 milligrams
gramos equivalentes de ácido gálico (EAG) por equivalent of gallic acid (EAG) per gram of
gramo de extracto y 28,12±0,06 miligramos extract and 28.12±0.06 milligrams equivalent of
equivalentes de catequina (Qe) por gramo de catechin (Qe) per gram of extract, respectively.
extracto, respectivamente. La secuenciación de Molecular sequencing of the evaluated isolates
los aislamientos evaluados mostró una alta simi- showed a high similarity (> 98%) with several
litud (>98%) con varias especies de Fusarium species of Fusarium sp and Alternaria sp,
sp y Alternaria sp, mientras que los ensayos while antifungal activity tests of the extract
de actividad antifúngica del extracto mostraron showed fungistatic activity by B. officinalis,
actividad fungistática por parte de B. officinalis with 16 mg.l-1 being the most effective treatment
al ser 16 mg.l-1 el tratamiento más efectivo para for both isolates evaluated with an inhibition
ambos aislamientos evaluados con un porcentaje percentage of 90.3±0.9% for Alternaria sp and
de inhibición de 90,3±0,9% para Alternaria sp 86.6±2.2% for Fusarium sp, where Alternaria sp
y 86,6±2,2% para Fusarium sp, donde Alter- presented greater susceptibility to the extract of
naria sp presentó mayor susceptibilidad frente B. officinalis leaves. Conclusion. The results of
al extracto de las hojas de B. officinalis. Con- this investigation provide one of the first reports
clusión. Los resultados de esta investigación of the antifungal activity of Borago officinalis on
proporcionan uno de los primeros reportes de la Fusarium sp and Alternaria sp.
actividad antifúngica de Borago officinalis sobre
Fusarium sp y Alternaria sp.
INTRODUCCIÓN de generar pérdidas millonarias en el sector
agrícola. Es un sector creciente que representa el
Hongos fitopatógenos como Fusarium sp 11,9% del territorio nacional (5 099 744 ha). De
y Alternaria sp producen micotoxinas las cua- este, el 40,2% se utiliza para cultivos como café,
les provocan daños graves a frutas y vegetales palma de aceite, caña de azúcar, entre otros, y
durante los procesos de recolección, transporte y un 20,3% se dedica a los cereales (DANE 2017).
almacenamiento, aspecto que afecta su vida útil, Adicionalmente, se encuentran los cultivos de
además de hacerlos no aptos para el consumo musáceas como banano del subgrupo Cavendish,
humano (Galvano et al. 2001, Pavón-Moreno que ocupan un área de 561 922 ha del territorio,
et al. 2012, Tirumale y Wani 2018). Estos hon- donde el 11,27% del área es destinado para su
gos son responsables del marchitamiento vascu- producción y exportación y el otro 88,76% es
lar, decadencia radicular, putrefacción, lesiones destinado para el consumo interno (ICA 2019).
necróticas, manchas en hojas y tallos. Asimismo, El interés generado por empresas expor-
su presencia también representa una amenaza tadoras para ingresar en los mercados inter-
para la salud de personas consumidoras debido a nacionales de productos provenientes de la
la producción de micotoxinas (Agrios 2005, Pal y actividad agrícola, ha promovido el incremento
Gardener 2006, Pavón-Moreno et al. 2012). de los estándares de calidad que a la vez gene-
Colombia representa regiones susceptibles ran sobrecostos de producción, entre los cuales
al ataque de organismos fitopatógenos capaces resalta el control de plagas y enfermedades.
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Tradicionalmente, el control de enfermedades de actividad antioxidante laxante, emoliente diu-
origen fúngico ha dependido del tratamiento con rético entre otros (Galle et al. 1993, Ratz-Łyko
agroquímicos (Chávez y Aquino 2012). Los agro- et al. 2014, Fernandes et al. 2019). Diversos
químicos representan un riesgo para el ambiente estudios sobre las propiedades fitoquímicas de B.
y la salud humana, los cuales pueden llegar a officinalis también han identificado la presencia
ser cancerígenos; además su uso genera residuos de actividad antimicrobiana frente a diversos
que contaminan el suelo, el aire, los cuerpos de patógenos de interés (Mhamdi et al. 2009, Aré-
agua y en algunos casos, son perjudiciales para valo 2009, Nieto-Navarro 2012, Basar et al. 2013,
la biota responsable del control natural de plagas Miceli et al. 2014, Ávila 2016).
y patógenos potenciales (Abdel-Monaim et al. Algunos extractos naturales presentan
2011, Rodríguez-Maturino et al. 2015, Tirumale actividad antifúngica por sus principios acti-
y Wani 2018). Ante este problema, una de las vos o “metabolitos secundarios”, los cuales son
posibles alternativas que permiten reducir las compuestos químicos que suelen estar presentes
enfermedades en plantas causadas por hongos en fuentes botánicas, además, no representan
fitopatógenos es el uso de extractos vegetales, un peligro para la salud humana (Lock et al.
los cuales han demostrado tener efectos como 2016). Los metabolitos secundarios presentes
controladores de ácaros, roedores, nematodos, pueden ser terpenoides, compuestos fenólicos,
bacterias, virus, hongos e insectos (Celis et al. fenilpropanoides, estilbenos, alcaloides, saponi-
2009, Boadu et al. 2011). Además, poseen poca nas, entre otros (Dixon 2001, Okwu y Nmamdi
o ninguna toxicidad contra el ser humano y son 2008). Algunos como los fenoles y flavonoides
rápidamente degradados en el suelo en compa- son responsables de actividad antimicrobiana,
ración con los agroquímicos utilizados actual- reportados principalmente contra Escherichia
mente (Corato et al. 2010, Mahlo et al. 2010, coli y Candida spp (Cushnie y Lamb 2005, Cora-
Rodríguez-Maturino et al. 2015). to et al. 2010, Echavarría et al. 2016, Abu et al.
Para un país en el que los sistemas agrí- 2017, Jasso de Rodríguez et al. 2019). En el caso
colas representan una de las formas de uso del de hongos se considera que la actividad antimi-
suelo más importantes, a su vez deberá ser parte crobiana de los metabolitos secundarios, está
de sus prioridades, la cual depende en parte, relacionada con la inhibición de la germinación
del buen mantenimiento y control biológico de de los conidios por parte de los hongos o por la
fitopatógenos (Moreno-Velandia et al. 2018). inactivación de la síntesis de aminoácidos esen-
Complementariamente, se debe considerar que ciales (Cushnie y Lamb 2005, Pietarinen et al.
Colombia posee entre 40 000 y 45 000 especies 2006, Kappel et al. 2008, De Castro et al. 2010).
de plantas lo que lo convierte en el segundo país En la actualidad existen pocos datos
a nivel mundial de diversidad de especies de las publicados acerca de la actividad de B. officina-
cuales al menos 6000 poseen propiedades medi- lis sobre especies de hongos fitopatógenas, por
cinales (Giraldo-Quintero et al. 2015), tradicio- lo cual el objetivo de este estudio fue evaluar in
nalmente es un país con una larga historia de uso vitro la actividad antifúngica del extracto eta-
de plantas como alimentos, medicina, vestuario nólico de hojas de Borraja (B. officinalis) sobre
y rituales ancestrales (Gómez-Fonnegra y Villa- hongos fitopatógenos productores de micoto-
Londoño 2011). xinas que provocan daños graves a cultivos de
Especies de plantas consideradas como frutas y verduras como Fusarium sp y Alternaria
malezas, tal como B. officinalis, son ampliamen- sp. Para lograr este objetivo, se identificaron
te utilizadas con fines medicinales y culinarios, metabolitos secundarios presentes en B. officina-
entre los que resaltan como una fuente rica de lis; además, se cuantificó el contenido de fenoles
ácido gamma linoleico, precursor de prosta- y flavonoides totales presentes en el extracto
glandinas antiinflamatorias; además, de poseer etanólico de hojas de B. officinalis. Además,
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Fusarium sp y Alternaria sp fueron caracteriza- hojas frescas separadas manualmente del tallo.
dos por estudios moleculares y bioinformáticas Estas fueron desinfectadas con hipoclorito de
mediante la amplificación de la región ITS del sodio 1% y, posteriormente, lavadas con agua
ADN ribosomal y finalmente, se determinó el destilada y secadas al aire durante 24 horas a
porcentaje de inhibición del crecimiento del temperatura ambiente; después, fueron tritura-
extracto de las hojas de B. officinalis sobre los das con una picadora y sumergidas en etanol
aislamientos previamente identificados mediante 98% en relación 1:2 en un recipiente de vidrio.
la prueba de crecimiento radial por técnica de Posteriormente, el recipiente fue envuelto en
difusión en agar. papel aluminio y se dejó en reposo durante 10
días. Después, el extracto fue filtrado y el mate-
rial vegetal se colocó de nuevo en el recipiente
MATERIALES Y MÉTODOS de vidrio con etanol 98% para reposar nueva-
mente durante 10 días. Este proceso se repitió
Obtención del material vegetal. El
en 3 ocasiones. Finalmente, el filtrado se secó
material vegetal de la maleza conocida con el
en rota evaporador durante 3 horas a 40ºC con
nombre de Borraja (B. officinalis) fue obtenido
una presión de 125 mbar. El secado final del
en noviembre de 2018 en Mendoza. Durante extracto fue en cabina de extracción de gases
ese proceso se consideró que las plantas fueran durante 5 horas a 30ºC.
ejemplares adultos y no presentaran signos de
enfermedad aparente, como la presencia de Identificación cualitativa y cuantifica-
pigmentos marrones, amarillos u oscuros en ción de los metabolitos secundarios. Con el fin
las hojas. Con el fin de corroborar la especie de determinar la composición general de meta-
utilizada, 4 muestras de B. officinalis fueron bolitos secundarios presentes en B. officinalis,
prensadas, con el protocolo para la entrega de se realizó un proceso fitoquímico propuesto por
colecciones botánicas y depositadas en el her- Lock (2016) (Figura 1). Para la fenoles se utilizó
bario de la Universidad Nacional de Colombia la prueba de cloruro férrico; para esteroles y
con la utilización del servicio de identificación metilesteroles, la de Salkowski; para esteroides
taxonómica para muestras botánicas para pro- y terpenos, la de Liberman-Buchard; para cou-
porcionar la correcta clasificación. marinas, se utilizó la de hidróxido de sodio; para
saponinas, la de espuma y para leucoantociani-
Obtención del extracto. El extracto de las dinas, la de HCl concentrado (Robles et al. 2016,
hojas de B. officinalis se obtuvo a partir de 1000 g de Navarrete et al. 2017).
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Figura 1. Identificación cualitativa de Alcaloides, Saponinas y Flavonoides, a partir de “Investigación Fitoquímica: Métodos
en el estudio de productos naturales” (Lock 2016).
Cuantificación de polifenoles y flavonoi- por Nabavi et al. (2008). Se mezclaron 100 µL
des. Los fenoles y flavonoides son considerados del estándar catequina (Qe) al 10% con 800 µL
los responsables de la actividad antimicrobiana de metanol, luego se adicionó 100 µL de AlCl3
en plantas (Kappel et al. 2008, De Castro et al. (10%) junto con 100 µL de acetato de sodio
2010), por lo cual se consideró importante su (0,1M), finalmente, se dejaron reposar durante 30
cuantificación. El contenido de total de polifeno- minutos a temperatura ambiente. La curva están-
les se determinó por el método Folin-Ciocalteau dar se preparó al utilizar como estándar catequi-
(Fo-Cio) y se siguió el método propuesto por na (15, 25, 35, 50, 75, 100 y 125 mg.l-1). El total
Cicco et al. (2009). Se mezclaron 100 µL de de flavonoides se expresó en miligramos equiva-
ácido gálico (reactivo analítico) con 200 µL del lentes de catequina (Qe) por gramo de extracto.
reactivo Folin-Ciocalteau al 10%, después de 4 La cuantificación de flavonoides se realizó por
minutos se agregaron 800 µL de solución acuo- triplicado a 420 nm en espectrofotómetro.
sa de Na2CO3 (700 mM). La mezcla se agitó y
calentó en baño maría a 40ºC durante 20 minu- Identificación molecular de los aisla-
tos, la curva estándar se preparó con el estándar mientos de hongos. Con el fin de caracterizar
acido gálico (15, 25, 40, 75, 100, 120 en mg.l-1). molecularmente los aislamientos de Fusarium
Para determinar el contenido de fenoles totales, sp y Alternaria sp de un cepario de hongos de
se expresó en miligramos equivalentes de ácido la Universidad Central donde fue realizado el
gálico (EAG) por gramo de extracto, la cuantifi- estudio para posteriormente ser conservados en
cación de polifenoles se realizó por triplicado a glicerina 15% a una temperatura de -20°C. Los
720 nm en espectrofotómetro (Thermo Scientific aislados fueron reactivados mediante la siembra
840-210300). en superficie en el medio de cultivo papa, dex-
Además, el contenido total de flavonoides trosa-agar (PDA) e incubados a 27°C durante 72
se determinó mediante los métodos propuestos horas. La extracción del ADN de los aislamientos
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se realizó con el kit de extracción Genomic (DMSO) y Tween 20 que son 2 reactivos común-
DNA™ Tissue MiniPrep (Zymo Research, Irvi- mente utilizados como vehículos por la industria
ne, EEUU), se siguieron las instrucciones del farmacéutica (Castro et al. 1995, Sánchez-Reci-
fabricante y se verificó en gel de agarosa. Pos- llas et al. 2020). Para la selección del vehículo,
teriormente se realizó una PCR para amplificar se evaluó la actividad antifúngica in vitro del
la región ITS del ADNr con los primers univer- extracto etanólico de las hojas de B. officinalis,
sales descritos por White et al. (1990). ITS1 (5’- mediante la prueba de crecimiento radial por
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-’3) e ITS4 técnica de difusión en agar. Para ello se utilizó
(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). La como medio de cultivo PDA con el extracto eta-
mezcla para la amplificación se realizó en un nólico disuelto en DMSO o en Tween 20, ambos
volumen de 90 mL con 12,5 mL de 10X PCR al 5% (Nieto Navarro 2012). Los trozos (6 mm
buffer MgCl2 (1,5Mm), 1 mL MgCl2, 3,75 mL de diámetro) de los aislamientos de Fusarium
de dNTP´S, ITS1 e ITS4, 1,25 mL de Taq ADN sp y Alternaria sp, de 7 días de crecimiento,
polimerasa y 1 mL ADN el cual fue estandari- fueron ubicados en el centro de la caja de Petri
zado a 10 ng. La amplificación se realizó en un para luego ser incubados durante 9 días a 27°C.
termociclador (BIO-RAD C1000 thermal cycler) Cada 3 días se realizó lectura del crecimiento
con un ciclo inicial de 94ºC por 5 minutos, 35 radial del micelio y el proceso fue realizado por
ciclos a temperatura de desnaturalización de triplicado. Como controles negativos se utilizó
94ºC por 1 minuto, una temperatura de anillado DMSO al 5% y Tween 20 al 5% en Agar PDA
de 56ºC por 30 segundos, una temperatura de sin de extracto vegetal y, como, control positivo
extensión de 72ºC por 30 segundos y un ciclo se utilizó un antifúngico comercial, el cual con-
final a 72ºC por 7 minutos. tiene propamocarb-HCl + metalaxyl a una con-
Asimismo, los productos de PCR fueron centración de 36 mg.l-1, según especificaciones
purificados con el uso del kit de purificación de del fabricante.
Zymo Research, Irvine, EEUU. Fueron secuen-
ciados mediante el método Sanger por servicio Ensayos de actividad antifúngica del
técnico en el SSIGMOL. La identificación de los extracto. La actividad antifúngica del extracto
aislamientos se determinó mediante el programa de las hojas de B. officinalis se llevó a cabo con
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) DMSO al 5% como vehículo y por la técnica de
del NCBI, estos resultados se compraron con la difusión en agar, con concentraciones de 6, 8,
base de datos RDP de Michigan State University 10, 12, 13, 14, 15 y 16 mg.l-1 de extracto vegetal
con el programa Classifier Fungal ITS Warcup (Nieto Navarro 2012). Para el análisis de los
por medio de un porcentaje de similitud de 95%. resultados, se calculó el porcentaje de creci-
miento micelial o radial respecto al control del
Selección del vehículo de siembra. medio inoculado con los hongos, se consideró
Varios fármacos y extractos experimentales no como el 100% del crecimiento radial o 0% de
se disuelven en agua o soluciones salinas y se inhibición del crecimiento micelial mediante
requiere de otros solventes, como detergentes o la siguiente ecuación (Ezziyyani et al. 2004,
aceites vegetales, que sean inocuos a los orga- Marquez-Vizcaino et al. 2007, Saúl et al. 2011,
nismos, este es el caso del Dimetilsulfóxido Bautista et al. 2016).
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Análisis estadístico. Para evaluar el RESULTADOS Y DISCUSIÓN
porcentaje de inhibición del crecimiento Fusa-
Identificación del material vegetal. El
rium sp y Alternaria sp frente a B. officinalis, material vegetal fue identificado en el laboratorio
todas las medidas fueron tomadas por triplica- según la descripción de Galle et al. (1993), De
do y expresadas como el valor ± la desviación Smet (1993) y Abu et al. (2017) como Borago
estándar. Además, los datos fueron analizados officinalis (Figura 2) donde se presenta tallo
mediante un análisis de varianza (ANOVA). ramificado, presencia de pubescencia por toda
De continuo, se comprobaron los supuestos de la planta hasta las hojas. Se identificaron hojas
alternas, anchas que decrecen en tamaño hacia el
normalidad y homoscedasticidad seguido de
ápice de la rama; las hojas basales son pecioladas,
una prueba de comparación múltiple de Tukey ovales, las caulinares, sésiles y lanceoladas. Por
con el uso de la herramienta IBM spss statis- su parte las flores que tienen forma de estrella de
tics v25 2017. color azul, con estambres negros (Simpson 1993).
Figura 2. Hojas y flores de Borago officinalis. A) Tallo ramificado, hojas alternas, anchas que decrecen hacia el ápice de la
planta. B) Flores de B. officinalis en forma de estrella de color azul, con estambres negros.
Además, se utilizó el servicio de Identificación cualitativa de metaboli-
estudio taxonómico para verificar la iden- tos secundarios. De acuerdo con los protocolos
tificación de B. officinalis realizado por el establecidos durante los ensayos cualitativos
Herbario Nacional de Colombia de la Univer- preliminares, se identificó la presencia de alca-
sidad Nacional de Colombia, donde se obtuvo loides, flavonoides, fenoles y saponinas; además,
una verificación de Borago officinalis con la presencia de esteroles y metilesteroles, este-
designación de muestra BO1 y número de roides y terpenos, coumarinas y leucoantociani-
colección 612220. dinas que fue negativa (Tabla 1). Los resultados
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coincidieron con los obtenidos por Echavarría et sin embargo, el contenido total de polifenoles es
al. (2016) quienes reportan resultados similares significativamente menor en comparación con
a excepción de polifenoles; por otra parte, Leos los reportados por Zemmouri et al. (2014), quie-
(2010) reportó la ausencia de flavonoides al nes reportaron un contenido total de polifenoles
aplicar la prueba de H2SO4. Otras investigacio- presentes en hojas de B. officinalis a partir de un
nes reportaron, de igual manera, la ausencia de extracto etanólico de 94,09±1,72 mg equivalentes
compuestos como esteroles, esteroides y terpenos de ácido gálico.g-1 de extracto.
(Mhamdi et al. 2009, Abu et al. 2017, Saadatian El contenido de polifenoles totales con-
et al. 2017). La presencia de compuestos como los cuerda con el registrado para varias plantas
fenoles y flavonoides sugiere que B. officinalis aromáticas y de uso medicinal (Zheng y Wang
puede presentar distintas propiedades entre las 2007). Además, el contenido de flavonoides
que destacan la capacidad antioxidante, antimi- totales difiere de los resultados obtenidos por
crobiana y antifúngica (Reddy et al. 2007, Siva et Zemmouri et al. (2014) en su estudio de la com-
al. 2008, Robles et al. 2016, Carvalho et al. 2018). posición química y antioxidante de B. officinalis,
pues se obtuvo como resultado 37,6±3,9 miligra-
Tabla 1. Identificación de metabolitos secundarios en el
extracto de las hojas de B. officinalis. mos equivalentes de catequina (Qe).g-1 de extrac-
to. La presencia de polifenoles y flavonoides en
Metabolitos Hojas de B. officinalis este estudio podrían indicar acción antifungica
Alcaloides +
(De Castro et al. 2010, Leon Duran y Mancheno
Cárdenas 2021).
Flavonoides +
Fenoles +
Identificacion molecular de los aisla-
Esteroles y Metilesteroles -
mientos de hongos. Las secuenciaciones de
Esteroides y Terpenos - regiones ribosomales con marcadores ITS sugie-
Coumarinas - ren que los aislamientos, identificados previa-
Saponinas + mente por su morfología pueden ser Fusarium
Leucoantocianidinas - sp y Alternaria sp. La amplificación de la banda
para los primers utilizados fue la esperada (500
Presencia = +
pb) según las secuenciaciones de Villavicencio
Ausencia = -
(2013), Vanegas Berrouet et al. (2014) y Salazar
Cuantificación de polifenoles y flavo- (2016), para F. oxyspoprum fue de 550 pb mien-
noides. El contenido total de polifenoles de tras que para Alternaria sp fue 580 pb.
las hojas de B. officinalis fue de 19,08±0,01 El análisis de la secuencia ITS realizado
(r2=0,97) reportado en miligramos equivalentes con la herramienta BLASTn del NCBI mostró
de ácido gálico (EAG) por gramo de extracto. una identidad de la secuencia del 99,83% para
Por otro lado, el contenido de flavonoides de Fusarium sp y la información fue depositada
las hojas de B. officinalis fue de 28,12±0,06 en el GenBank del NCBI con el número de
(r2=0,99), reportado como miligramos equiva- acceso KP942940.1. La secuencia para Alter-
lentes de catequina (Qe) por gramo de extracto. naria sp mostró una identidad del 99% con
El contenido total de polifenoles de las hojas varias especies como Alternaria arborescens y
de B. officinalis concuerda con los resultados Alternaria alternata (números de acceso Gen-
obtenidos por Segovia et al. (2014), en el que sus Bank: MK460794.1, JQ910882.1, MK461082.1,
resultados variaron de 19,16 a 27,49 mg equiva- MN044802.1), por lo que no se logró especificar
lentes de ácido gálico.g-1 de extracto, en las hojas claramente la especie y, por tanto, fue denomina-
de B. officinalis a partir de un extracto etanólico; da Alternaria sp.
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Con el fin de constatar los resultados Alternaria sp, ya que debido a la gran cantidad
señalados, las secuencias se compararon con la de polimorfismo que existe entre especies estre-
base de datos RDP de Michigan State Univer- chamente relacionadas, se recomienda el uso de
sity, mediante el programa Classifier Fungal más primers como TEF-1α o RPB2 (Geiser et
ITS Warcup, el cual mostró resultados similares al. 2004, Salazar-González et al. 2016, Rangel-
para ambos casos, que sugieren la presencia de Castillo et al. 2017), razón por la cual se decidió
F. oxysporum con un umbral de confianza del no atribuir ninguna especie para los aislamientos
95%; mientras que Alternaria sp obtuvo 56% secuenciados.
de identidad con Alternaria alternata con un Selección del vehículo de siembra. El
umbral de confianza del 95%, sin embargo, crecimiento radial de Fusarium sp y Alter-
es definida como Alternaria_no identificada. naria sp se afectó de manera negativa por
Según los resultados, se toma la decisión de no el extracto de B. officinalis mediante los
atribuir ninguna especie para el caso de Alter- vehículos DMSO al 5% y Tween 20 al 5%.
naria sp. No obstante, la secuenciación de la Sin embargo, el extracto de B. officinalis
región ribosomal con marcadores ITS puede no presentó mayor porcentaje de inhibición para
ser concluyente para la correcta identificación los 2 aislamientos evaluados con DMSO-5%
molecular de los aislamientos de Fusarium sp y (Figura 3).
Figura 3. Efecto antifúngico del extracto de las hojas de B. officinalis sobre Fusarium sp y Alternaria sp después de 3, 6 y 9
días mediante DMSO 5% y Tween-20 5%.
En el caso de Fusarium sp, los tratamien- inhibición donde el control (+) fue el tratamiento
tos se dividieron en 2 grupos estadísticamente más efectivo frente a Fusarium sp (64,7±0,5%),
diferentes (ANOVA p18 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
En la Figura 3, se observa que la inhibi- evaluados (Figura 3) (Ravindran et al. 2011, Boba-
ción de B. officinalis sobre Fusarium sp, dismi- dilla Alvarez y Reyes Castro 2020).
nuye a través del tiempo (6 y 9 días), ya que es Algunos vehículos, como Tween 20, pue-
el extracto disuelto en DMSO-5% el tratamiento den disminuir la actividad locomotora del extrac-
más efectivo frente a Fusarium sp (40,0±5,1%) al to al impedir la correcta dilución en el medio
final del experimento. inoculado, lo cual reduce su eficiencia (Castro
Para el caso de Alternaria sp se observó et al. 1995). Recursos como Tween 20 y Tween
que el extracto de las hojas de B. officinalis 80 pueden inactivar compuestos fenólicos que
inhibió el crecimiento en mayor porcentaje con han sido reportados como los encargados de la
respecto al Fusarium sp (Figura 3). Los resulta- actividad antimicrobiana presente en los extractos
dos se dividieron en 2 grupos estadísticamente de plantas (Dixon 2001, Akhila 2009). La selec-
diferentes (ANOVA pVILLOTA-BURBANO & VAZQUEZ-OCHOA: Actividad fungistática de hojas de borraja 19
Figura 4. Efecto antifúngico de diferentes dosis del extracto de las hojas de B.officinalis sobre Fusarium sp después de 3, 6 y 9 días.
Para el caso de Fusarium sp, los tratamien- el último grupo conformado por el tratamiento
tos se dividieron en 6 grupos estadísticamente con concentración de 6 mg.l-1 y mostró menor
diferentes (ANOVA p20 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
Figura 5. Actividad de Borago officinalis contra Fusarium sp. A) Fusarium sp al cabo de 9 días de tratamiento a una
concentración de 16 mg.l-1. B) Control (-) Fusarium sp al cabo de 9 días.
En contraste con los resultados obtenidos Para el caso de Alternaria sp los trata-
por Nieto-Navarro (2012), quien evaluó el efecto mientos se dividieron en 3 grupos estadística-
antifúngico de varias plantas medicinales entre mente diferentes (ANOVA pVILLOTA-BURBANO & VAZQUEZ-OCHOA: Actividad fungistática de hojas de borraja 21
Figura 6. Efecto antifúngico de diferentes dosis del extracto de las hojas de B.officinalis sobre Alternaria sp después de 3, 6 y 9 días.
Al igual que para el caso de Fusarium sp, primer grupo fue conformado por los tratamientos
la inhibición de B. officinalis sobre Alternaria de 14, 15 y 16 mg.l-1 los cuales presentaron más
sp disminuyó a través del tiempo (6 y 9 días). efectividad frente a Alternaria sp (100%). El trata-
Después de 6 días, los tratamientos se dividieron miento más efectivo al final de 9 días fue 16 mg.l-1
en 6 grupos estadísticamente diferentes, donde el frente a Alternaria sp (90,3±0,96%) (Figura 7).
Figura 7. Actividad de Borago officinalis contra Alternaria. sp. A) Alternaria sp al cabo de 9 días de tratamiento a una
concentración de 16 mg.l-1. B) Control (-) Alternaria sp al cabo de 9 días.
Agronomía Costarricense 45(2): 9-27. ISSN:0377-9424 / 202122 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
Se evidenció un contraste con los resul- de reducir la sensibilidad en el sitio de acción de
tados obtenidos por Arévalo (2009), quien solo manera que antifúngico no pueda fijarse al sitio
reportó actividad antifungica frente a Alternaria de acción, al inhibir o reducir significativamente
sp. Khafari et al. (2014) evaluaron el efecto de B. su efectividad (Hernández 2012).
officinalis sobre Alternaria sp en una concentra- Existe un riesgo intrínseco en la apli-
ción de 5 mg diluidos sobre discos de papel, ya cación de las dosis de los extractos vegetales
que reportaron la ausencia de actividad antifún- o fungicidas, además, de la subdivisión de las
gica, a diferencia de los obtenidos en el presente mismas, ya que se ejerce mayor presión de selec-
estudio, que fue la concentración mínima evalua- ción, lo cual favorecería la supervivencia de una
da de 6 mg.l-1 con el uso de la técnica de dilución parte de la población de hongos menos sensibles
en agar con vehículo de dilución (DMSO-5%). a los principios activos aplicados, en ese sentido
La inhibición observada se considera alta- el fungicida ejerce presión sobre el hongo y mata
mente efectiva de acuerdo con Marquez-Vizcaino solo a la población sensible (Hobbelen et al. 2011,
et al. (2007) al presentar un porcentaje de ≥20%. Gressel 2011, Hollomon 2012, Grimmer et al.
Sin embargo, el extracto de B. officinalis mostró 2015, Carmona y Sautua 2017).
la presencia de actividad fungistática, ya que el Eidi et al. (2014) reportan la presencia
crecimiento de Fusarium sp y Alternaria sp fue de actividad antifúngica de B. officinalis en 3
reactivado al cabo de 3 días para la mayoría de especies de hongos fitopatógenos del género de
las concentraciones evaluadas, excepto 16 mg.l-1 Aspergillus (A. fumigatus, A. niger y A. flavus),
donde el crecimiento fue reactivado después 6 resultados que corroboran el potencial antifúngi-
días (Soylu et al. 2010, Moreno 2011). co por parte de B. officinalis. Gatto et al. (2011)
Los resultados obtenidos pueden relacio- también reportaron la presencia de actividad
narse con la presencia de compuestos fenólicos antifúngica de B. officinalis sobre Botrytis ciné-
por parte de B. officinalis, comúnmente rela- rea, Monilia laxa, Aspergillus niger, Aspergillus
cionados con la actividad antimicrobiana de los carbonarius, entre otros.
extractos vegetales (Gatto et al. 2011, Rodriguez-
Maturino et al. 2015, Fabrikov et al. 2019). La CONCLUSIONES
presencia de compuestos fenólicos en el extrac-
to de B. officinalis corroboraron la presencia de El extracto etanólico de las hojas de Bora-
la actividad antifúngica que actúa como repe- go officinalis expuso un alto contenido de fenoles
lente, además de inhibir la acción enzimática y flavonoides totales que hacen de esta planta
por oxidación de las topoisomerasas implicadas una especie promisoria por los beneficios que
en procesos de transcripción y reparación del podría ofrecer en el control biológico de hongos
ADN (Lizcano González 2007, De Castro et fitopatógenos.
al. 2010, Azuero et al. 2016, Mesa et al. 2019). El extracto etanólico de las hojas de Bora-
Además, atacan la membrana citoplasmática del go officinalis fue efectivo en el control in vitro
patógeno, lo cual afecta la capacidad selectiva y de Fusarium sp y Alternaria sp, con resultados
permite el escape de componentes intracelula- similares al fungicida comercial propamocarb-
res (Nychas 1995). HCl + metalaxyl, el cual es de uso común.
La pérdida de actividad fungicida del Se demostró la actividad antifúngica del
extracto de las hojas de B.officinalis sobre Fusa- extracto etanólico de las hojas de Borago offi-
rium sp y Alternaria sp respondió a sus meca- cinalis, lo que sugiere que su aplicación puede
nismos de resistencia entre los que destaca la ser una alternativa para su empleo en el manejo
resistencia metabólica por parte de especies agroecológico de los hongos fitopatógenos.
patógenas mediante la acción enzimática. Inclu- La investigación reportó la evaluación
so para el caso de hongos y malezas son capaces del extracto etanólico de Borago officinalis
Agronomía Costarricense 45(2): 9-27. ISSN:0377-9424 / 2021VILLOTA-BURBANO & VAZQUEZ-OCHOA: Actividad fungistática de hojas de borraja 23
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blecer la concentración mínima inhibitoria del Basar, SN; Rani, S; Farah, SA; Zaman, R. 2013. Review on
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