Identificación de Cromosomas Homólogos Mediante Correlación Digital de Patrones de Difracción
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MERIDA YUCATAN 2003 XLVI CONGRESO NACIONAL SMF / XVI REUNION ANUAL AMO
Identificación de Cromosomas Homólogos Mediante Correlación
Digital de Patrones de Difracción
Cristian Gallardo Escárate1,2, Josué Álvarez-Borrego2, Miguel Ángel del Río Portilla1
y Vitaly Kober3.
Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada.
Km 107 Carretera Tijuana – Ensenada, Código Postal 22860. Ensenada, B.C. México.
(1)
División de Oceanología, Departamento de Acuicultura.
(2)
División de Física Aplicada, Departamento de Óptica,
(3)
Depto. de Ciencias de la Computación
gallardo@cicese.mx, josue@cicese.mx, midelrio@cicese.mx, vkober@cicese.mx
RESUMEN
El estudio citogenético aborda la identificación de cromosomas homólogos, es decir los cromosomas
aportados por la vía paterna y materna respectivamente. El presente estudio plantea una nueva
metodología de reconocimiento de cromosomas homólogos mediante correlación digital de patrones de
difracción equivalente al modulo al cuadro de la transformada de Fourier. Para probar la utilización de
correlación digital de cromosomas homólogos se utilizó como material de estudio, placas metafásicas
provenientes de larvas de abulón rojo del Pacífico, Haliotis rufescens. A través de la correlación digital fue
posible identificar 18 pares de cromosomas homólogos en el abulón rojo del Pacifico Haliotis rufescens. El
cariotipo muestra ocho pares de cromosomas metacéntricos, nueve pares submetacéntricos y un par
cromosómico subtelocéntrico. El presente estudio plantea la utilización de patrones de difracción para la
identificación de cromosomas en distintos tipos de organismos.
INTRODUCCIÓN
A través del análisis citogenético, es posible describir las características de los cromosomas de un organismo. En este
sentido, el establecimiento de la identidad cromosómica es el primer paso para los estudios de mapeo genómico, los
cuales pueden ser utilizados en análisis taxonómicos, dado que cada especie posee un cariotipo distintivo, en términos de
número y morfología de los cromosomas. De igual forma es posible utilizar los análisis citogenéticos para estudiar
enfermedades derivadas de anomalías cromosómicas (Gersen & Keagle, 1999).
Los cromosomas son reconocidos como portadores de ADN en eucariontes, dado que proveen la base estructural para la
transmisión de la información genética. Las características morfológicas de los cromosomas han sido estudiadas con
microscopía de alta resolución aunado a tinciones especificas de ADN. Características morfológicas comunes, como
constricción primaria (centrómero) en diferentes posiciones a lo largo del cromosoma ha permitido la identificación y
clasificación cromosómica (Appels et al., 1998).
Sin duda una de las mayores problemáticas en citogenética es la identificación de cromosomas homólogos (par
cromosómico aportado por ambos parentales). Dicha identificación es posible realizarla por mediciones morfológicas de
los brazos cromosómicos, además de la utilización de tinciones especificas (patrones de bandeo). La utilización de
análisis de imagen permite obtener un filtro compuesto, construido con base en las distintas variaciones morfológicas
que pueden producirse durante el proceso citogenético. Metodologías como correlación digital se plantean como una
nueva herramienta para el análisis cromosómico en distintos organismos.
El objetivo del presente estudio es utilizar procedimientos de correlación digital de patrones de difracción para la
identificación de cromosomas homólogos.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de cromosomas
Imágenes cromosómicas fueron obtenidas desde placas metafásicas en larvas de abulón rojo del Pacifico, Haliotis
rufescens 24 hrs. post-fertilización. Las larvas fueron seleccionadas y transferidas a una solución de 0.005% de
colchicina durante 3-4 Hrs. Después del tratamiento antimitótico las muestras fueron colocadas en una solución
hipotónica al 50% en agua destilada durante 45 min. Al término del tratamiento hipotónico las muestras fueron fijas en
solución Carnoy (3:1, metanol: ácido acético). Para la obtención de placas metafásicas, disociaciones celulares de las
muestras fijadas fueron goteadas sobre una platina a 45ºC y posteriormente dejadas secar al aire.
Imágenes cromosómicas
Las imágenes cromosómicas fueron obtenidas desde placas metafásicas sin teñir. Las mejores placas fueron digitalizadas
con frame gabber de 24-bit (modelo CG-7, Scion Corp) usando una microscopio de contraste de fases marca Zeizz,
modelo Axiolab y equipado con una cámara video RGB modelo 1040, marca COHU. Las imágenes citogenéticas fueron
preprocesadas para la eliminación de ruido, mejora de contraste y conversión de RGV a escala de grises, mediante
filtros morfológicos según Kober et al. (2002).
La identificación de cromosomas homólogos fue desarrollada mediante correlación digital. Después de la identificación
de los cromosomas homólogos, se determino la morfometría de los cromosomas mediante el software Image Pro-Plus
software versión 4.0 (Copyright© 1993-1998 Media Cybernetics). Las mediciones de los cromosomas fueron utilizadas
para realizar una análisis cariotípico.
a b
Figura 1. Imagen cromosómica de abulón rojo del Pacifico, Haliotis rufescens. a) Imagen original obtenida a través del CCD. b)
Imagen pre-procesada.
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+
Filtro parabólico
F ( w X , wY ) 2 F ( w X , wY ) 2
fn( x, y )
Correlación
Digital
F ( w X , wY ) 2
Ordenamiento aleatorio
RESULTADOS
Figura 2. Proceso de correlación digital para la identificación de cromosomas homólogos.
La figura 1 muestra el resultado del pre-procesamiento de las imágenes utilizadas para el estudio. Mediante la aplicación
de correlación digital de patrones de difracción fue posible identificar los 18 pares de cromosomas homólogos en el
abulón rojo del Pacifico Haliotis rufescens (Figura 2). Las observaciones de imágenes cromosómicas permitió establecer
un número diploide de 36 cromosomas. Los valores medios de las longitudes relativas y longitudes totales de los
cromosomas se muestran en la Tabla 1. La razón de las longitudes de los brazos cromosómicos, indica que esta especie
posee 8 pares de cromosomas metacéntricos (Cromosomas Nº 1, 3, 6, 7, 14, 15, 17 y 18), nueve pares submetacéntricos
(Nº 2, 5, 4, 8, 9, 10, 11, 12 y 13) y un par de cromosomas subtelocéntrico (Nº 16) (Figura 3). Los pares 17 y 18 fueron
difíciles de identificar usando solo características morfológicas debido al traslape de las desviaciones estándar.
DISCUSIÓN
La mayoría de los estudios citogenéticos disponibles hasta ahora, establecen las diferencias cromosómicas a partir del
análisis cariológico clásico. Los cromosomas son clasificados cualitativamente en categorías (metacéntrico,
submetacéntrico, subtelocéntrico y telocéntrico) con base en la relación de la longitud entre el brazo largo y brazo corto
de cada par cromosómico (Levan et al., 1964). Este método separa la variación continua de la posición del centrómero
en clases discretas, no considera el tamaño absoluto de cada cromosoma. Este procedimiento considera diferentes a pares
cromosómicos similares que caen en distintas clases cualitativas o considera iguales a pares que, siendo distintos caen
dentro de la misma categoría. Estas variaciones morfológicas debidas al grado de condensación del ADN en los
cromosomas pueden originar errores en la identificación adecuada del cariotipo de una especie o individuo. Lo anterior
ha hecho necesario la búsqueda de modificaciones a la metodología clásica propuesta por Levan et al. (1964) y de
nuevos procedimiento de identificación y clasificación cromosómica.
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La utilización de análisis de imágenes para estudiar distintos aspectos citogenéticos reduce el error ocasionado por las
mediciones manuales, al permitir realizar aproximaciones más cuantitativas y detalladas de la naturaleza morfológica de
los cromosomas (Schrock et al., 1996). El análisis propuesto en el presente estudio plantea la utilización del modulo al
cuadrado de la transformada de Fourier (proporcional al patrón de difracción) de imágenes digitales como el punto de
partida para la identificación de los aspectos citogenéticos de interés. Esta metodología es una alternativa a los métodos
tradicionales de identificación cromosómica con base en mediciones morfológicas y tinciones especiales.
El próximo paso en la aplicación de metodologías de correlación digital es integrar técnicas invariantes, es decir,
técnicas que reconocen como idénticos a objetos iguales a pesar de tener cambios de posición, escala, rotación, entre
otras. Sin embargo el procesamiento invariante es una tarea difícil y motivo por el cual, las técnicas encaminadas a
resolver este problema son variadas (Zavala-Hamz & Álvarez-Borrego, 1996; Zavala-Hamz & Álvarez-Borrego, 1997;
Pech Pacheco et al., 1998; Castro-Longoria et al., 2001; Pech Pacheco et al., 2001; Pech Pacheco et al., 2002; Kober et
al., 2002; Álvarez-Borrego et al., 2002; Álvarez-Borrego & Castro-Longoria, 2003: Pech Pacheco et al., 2003).
Tabla 1. Longitud relativa (LR) y longitud total (LT) de cromosomas in Haliotis rufescens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico;
ST, subtelocéntrico.
Cromosoma LR (%) LT (µm) Tipo
1 6.52 ± 0.56 5.67 ± 0.194 M
2 6.42 ± 1.03 5.58 ± 0.072 SM
3 6.20 ± 0.55 5.39 ± 0.069 M
4 6.09 ± 0.78 5.30 ± 0.106 SM
5 6.03 ± 0.91 5.24 ± 0.011 SM
6 5.97 ± 0.26 5.20 ± 0.035 M
7 5.84 ± 0.44 5.08 ± 0.132 M
8 5.83 ± 0.68 5.07 ± 0.073 SM
9 5.74 ± 1.01 4.99 ± 0.078 SM
10 5.34 ± 0.80 4.65 ± 0.045 SM
11 5.32 ± 0.70 4.63 ± 0.093 SM
12 5.26 ± 0.52 4.58 ± 0.029 SM
13 5.17 ± 0.78 4.50 ± 0.040 SM
14 5.10 ± 0.17 4.44 ± 0.076 M
15 4.96 ± 0.31 4.32 ± 0.051 M
16 4.95 ± 1.63 4.31 ± 0.056 ST
17 4.45 ± 0.27 4.46 ± 0.060 M
18 4.31 ± 0.34 3.75 ± 0.071 M
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AGRADECIMIENTOS
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, proyecto CONACYT 36075-B “Procesado e Identificación de
Partículas Biogénicas”.
LITERATURA CITADA
Alvarez-Borrego, J. & E. Castro-Longoria (2003). Discrimination between Acartia (Copepoda: Calanoida) species using
their diffraction pattern in a position, rotation invariant digital correlation. Journal of Plankton Research. 25(2):
229-233.
Alvarez-Borrego, J., M.-P. Reyna, R., G. Cristóbal & J. Pech-Pacheco (2002). Invariant optical color correlation for
recognition of Vibrio cholerae 01. Optical Engineering. 41(4): 827-833.
Appels, R., R. Morris, B. Gill & C. May (1998). Chromosome Biology. New York, Kluwer Academic Publishers.pp
4401.
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