DE PRUEBAS DE ALK EN CANCER DE PULMON - ATLAS DE LA IASLC EDITADO POR DR. MING SOUND TSAO, FRCPC DR. FRED R. HIRSCH, PHD DR. YASUSHI YATABE, PHD
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Editado por
DR. Ming SOUND Tsao, FRCPC
DR. Fred R. Hirsch, PhD
DR. Yasushi Yatabe, PhD
Atlas de la IASLC ’ ’
de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn
international Association for the Study of Lung Cancer
Atlas de la IASLC
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de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn
International Association for the Study of Lung Cancer, Aurora, Colorado, EEUU Editores: Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC Dr. Fred R. Hirsch, PhD Dr. Yasushi Yatabe, PhD Una publicación de la IASLC publicada por IASLC Press Patricia Vigués, Spanish translation Cubierta original y diseño del libro por Biographics Oficina de Prensa de la IASLC: IASLC, 13100 East Colfax Ave., Unit 10, Aurora, Colorado 80011, EEUU www.iaslc.org Primera publicación por la IASLC Octubre 2013 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ISBN: 978-1-940488-04-2 Copyright ©2013 International Association for the Study of Lung Cancer Reservados todos los derechos Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada, introducida o transmitida en cualquier forma o por cualquier medio sin permiso previo y por escrito del titular del copyright. Aunque la información de este libro se cree que es verdadera y exacta a partir de la fecha de publicación, ni la IASLC ni los editores ni la editorial aceptan ninguna responsabilidad legal por cualquier error u omisión que pueda haber. La editorial no ofrece ninguna garantía, expresa o implícita, en cuanto al material contenido en el mismo.
Atlas de la IASLC
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de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn
Editado por
Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC
Dr. Fred R. Hirsch, PhD
Dr. Yasushi Yatabe, PhD
international Association for the Study of Lung Cancer
Agradecimientos La IASLC agradece la generosa aportación y apoyo proporcionado por Pfizer Oncology para este atlas de pruebas de ALK. Los co-editores y todos los colaboradores también agradecen la asistencia editorial de Lori Alexander, MTPW, ELS, el apoyo de Deborah A. Whippen, Editorial Rx, Inc., y Rania Gaspo, PhD, Pfizer Oncology, durante la preparación de esta publicación.
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Indice
Lista de colaboradores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Abreviaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Fabricantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Capítulo 1 Candidatos para las pruebas de ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Capítulo 2 Obtención de muestras, procesamiento y diagnóstico general
de procedimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Capítulo 3 Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Capítulo 4 La Inmunohistoquímica (IHC). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Capítulo 5 Retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR
por sus Siglas en Inglés) y varios ensayos genéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Capítulo 6 Comparación de diferentes plataformas de ensayo para
pruebas de ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Capítulo 7 Análisis de ALK en citología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Capítulo 8 Presentación de informes de la prueba ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Capítulo 9 Líneas de actuación y estudios de estandarización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Capítulo 10 Resumen y perspectivas futuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Anexo 1 Resumen de estudios publicados sobre las pruebas de
reordenamiento del gen ALK en cáncer de pulmón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Anexo 2 Guía de pruebas moleculares propuestas por CAP/IASLC/AMP
para la selección de pacientes con cáncer de pulmón elegibles
para el tratamiento con inhibidores de la tirosina cinasa
para EGFR y ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
6
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Lista de colaboradores
Editores
Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC Dr. Fred R. Hirsch, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD
Patólogo y Científico Senior, Profesor, Departamento de Medicina Jefe de Departamento de Patología y
Princess Margaret Cancer Centre, Departamento de Patología Diagnóstico Molecular,
University Health Network University of Colorado en Denver Aichi Cancer Center
Profesor, Departamento de Medicina Denver, Colorado, EE.UU. Nagoya, Japón
De Laboratorio y Patobiología,
University of Toronto
Toronto, Canadá
Autores colaboradores
Dra. Elisabeth Brambilla, PhD Keith M. Kerr, FRCPath Dr. Erik Thunnissen, PhD
Profesora, Département d’Anatomie Profesor, Departamento de Patología Patólogo, Consultor, VU University
et Cytologie Pathologiques Aberdeen University Medical School Medical Center
INSERM U823 Institut Albert Bonniot Aberdeen Royal Infirmary Amsterdam, Holanda
Centre Hospitalier Universitaire de Aberdeen, Escocia, Reino Unido
Grenoble, Université Joseph Fourier Marileila Varella-Garcia, PhD
Grenoble, Francia Dra. Sylvie Lantuéjoul, PhD Profesora, Departamento de
Profesor y Presidente del Departement Medicina/Oncología Médica
Dr. Lukas Bubendorf d’Anatomie et Cytologie Pathologiques Departamento de Patología
Profesor y Jefe de la División de INSERM U 823 Institut Albert Bonniot University of Colorado en Denver
Citopatología Centre Hospitalier Universitair A Denver, Colorado, EE.UU.
Instituto de Patología, Michallon, Université Joseph Fourier
University Hospital Basel Grenoble, Francia Dr. Ignacio Wistuba
Basel, Suiza Profesor y Presidente emérito de Jay
Dr. Kengo Takeuchi, PhD and Lori Eisenberg
Dr. Jin-Haeng Chung, PhD Objetivos Moleculares en Patología Departamento de Patología Molecular
Profesor, Departamento de Patología Instituto del Cáncer Traslacional
Seoul National University Bundang División de Patología del Cancer University of Texas MD Anderson
Hospital Institute Hospital Cancer Center
Seoul, Corea del Sur Fundación Japonesa para la Houston, Texas, EE.UU.
Investigación del Cáncer
Tokyo, Japón Dr. Akihiko Yoshida, PhD
Patólogo, Departamento de
Patología
National Cancer Center Hospital
Tokyo, Japón
Asistentes al Workshop IASLC ALK Testing,
Sorrento, Italia, 2013. Primera fila, de izquier-
da a derecha–Y. Yatabe, M. Varella-Garcia,
E. Brambilla, S. Lanteujoul, R. Gaspo (Pfizer
Oncology), J-H Chung. Última fila, de izquierda
a derecha–A. Yoshida, I. Wistuba, F. R. Hirsch, M.
S. Tsao, E. Thunnissen, L. Bubendorf, K. Kerr.
7
Abreviaturas
Abreviaturas
Las siguientes abreviaturas se usan en el texto:
AEC: 3-amino-9-etilcarbazol
ALK: cinasa del linfoma anaplásico
AMP: Asociación de Patología Molecular
ATS: Sociedad Torácica Americana
CAP: Colegio de Patólogos Americanos
CISH: hibridación in situ cromogénica
CPCP: cáncer de pulmón de células pequeñas
CPCNP: cáncer de pulmón de células no pequeñas
DAB: 3, 3’ diaminobencidina
EBUS: ecografía endobronquial
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico
EML4: proteína 4 asociada al microtúbulo del equinodermo
ERS: Sociedad Respiratoria Europea
ETOP: Plataforma Oncológica Torácica Europea
FDA: US Food and Drug Administration
FFPE: fijado en formol e incluido en parafina
FISH: hibridación in situ fluorescente
H&E: hematoxilina & eosina
HER2: factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2
iAEP: polímero intercalado de anticuerpos mejorado
IASLC: Asociación Internacional para el Estudio de Cáncer de Pulmón
IHC: inmunohistoquímica
ISH: hibridación in situ
KIF5B: miembro de la familia cinesia 5B
NOS: no especificado
NGS: secuenciación de nueva generación
PAAF: Punción-aspiración con aguja fina
RET: proto-oncogen ret
ROS1: ros oncogen 1
RT-PCR: retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa
TKI: inhibidor de la tirosina cinasa
USE: ecografía transesofágica
v: variante
8
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Fabricantes
Los siguientes fabricantes y sus productos se destacan en este Atlas. Las localizaciones dadas por
cada fabricante no son únicas. La mayoría de los fabricantes tienen oficinas en todo el mundo.
Abbott Molecular Leica Biosystems
Abbott Park, Illinois, EE.UU. Buffalo Grove, Illinois, EE.UU.
Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, Wetzlar, Alemania
Spectrum Orange Probe, and Spectrum Bond-Max, Novolink Polymer Detection
Green Probe System
Abcam Nichirei Biosciences, Inc.
Cambridge, Reino Unido Tokyo, Japón
Anticuerpo Anti-ALK (5A4) Anticuerpo 5A4 (Histofine ALK Detection Kit)
BD (Becton, Dickinson and Company) Novocastra
Diagnostics Newcastle, Reino Unido
Franklin Lakes, New Jersey, EE.UU. Anticuerpo 5A4
SurePath
NanoString Technologies
Cell Signaling Technology Seattle, Washington, EE.UU.
Danvers, Massachusetts, EE.UU. NanoString assay
Anticuerpo D5F3 (ALK [D5F3] XP Rabbit mAb)
Pfizer Oncology
Dako New York, New York, EE.UU.
Glostrup, Dinamarca XalkoriTM
Carpinteria, California, EE.UU.
ADVANCE, anticuerpo ALK1, EnVision, Ventana Medical Systems, Inc.
EnVision+, EnVision FLEX, y EnVision FLEX+, PT (miembro del grupo Roche)
Link, y Target Retrieval Solution Tucson, Arizona, EE.UU.
BenchMark XT, iVIEW DAB Detection Kit,
Hologic, Inc. OptiView DAB IHC Detection Kit, OptiView
Bedford, Massachusetts, EE.UU. Amplification Kit, y ultraView Universal
ThinPrep DAB Kit, y Ensayo de Anticuerpo Primario
Monoclonal de Conejo
Invitrogen, Life Technologies Corporation
Carlsbad, California, EE.UU. ZytoVision GmbH
Anticuerpo Anti-ALK Bremerhaven, Alemania
ZytoDot 2C SPEC ALK break-apart probeINTRODUCCIÓN
Por Ming Sound Tsao, Fred R. Hirsch y Yasushi Yatabe
En los últimos años, el diagnóstico y el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón avanzado
ha sufrido grandes cambios. El modelo actual para la prescripción de nuevas terapias especializa-
das se basa en la selección de pacientes de acuerdo a la presencia de anormalidades oncogénicas
específicas en el tumor. Las primeras anomalías en ser descubiertas en el cáncer de pulmón fueron
las mutaciones en el dominio cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Se
encontró que los tumores con estas mutaciones tenían sensibilidad a los inhibidores de la tirosina
cinasa de EGFR (TKIs). Desde entonces, el gen de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK) se ha conver-
tido en el segundo oncogén diana en el cáncer de pulmón para el que se han desarrollado nuevas
terapias altamente efectivas. El nuevo gen de fusión ALK está formado por un reordenamiento que
ocurre en el brazo corto del cromosoma 2 y afecta a los genes que codifican para ALK (2p23.2) y la
proteína 4 asociada al microtúbulo del equinodermo (EML4) (2p21) o, raramente, a los genes en otros
cromosomas. El producto proteíco de este nuevo gen de fusión tiene una cinasa constitutivamente
activa de ALK porque el dominio básico del gen EML4 proporciona un mecanismo para la dimeri-
zación de la nueva proteína quimérica. Se han identificado numerosas variantes de reordenamiento
del gen de fusión EML4-ALK en los diferentes tipos de cáncer de pulmón. Las fusiones implican la
parte del extremo N-terminal del gen EML4 y el dominio de cinasa en la parte C-terminal del gen ALK.
Debido a que esta reordenación génica implica una gran inversión y translocación cromosómica,
la hibridación in situ fluorescente (FISH) se ha convertido en el método elegido para la detección
de todas las formas de reordenamiento del gen ALK, y fue el ensayo utilizado para detectar esta
aberración genética en los primeros ensayos clínicos del inhibidor de ALK, crizotinib (Xalkori®, Pfizer
Oncology) (Bang 2010, Kwak 2010, Camidge 2012). Por lo tanto, FISH y las sondas break-apart para
detectar reordenamiento se han convertido en el método estándar para el diagnóstico de cáncer
de pulmón con el reordenamiento ALK, y la Food and Drug Administration (FDA) de los EE.UU.
ha aprobado la prueba Vysis LSI ALK Break-Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular) para ello. Este
ensayo, junto con criterios bien definidos para los resultados positivos y negativos, se utilizó para
identificar a los pacientes con cáncer de pulmón avanzado de células no pequeñas (CPCNP) que eran
positivos para el reordenamiento del gen ALK. En un estudio fase I/II, la tasa de respuesta objetiva con
crizotinib fue del 61% y una mediana de supervivencia libre de progresión de 9,7 meses (Camidge
2012). En un estudio en fase III aleatorizado (PROFILE 1007), en la que crizotinib se comparó con la
quimioterapia en pacientes en los que la enfermedad había progresado durante la quimioterapia
convencional, la tasa de respuesta objetiva con el tratamiento con crizotinib fue del 65 % (comparada
con el 20% para la quimioterapia) y una mediana de supervivencia libre de progresión de 7,7 meses
(en comparación con 3,0 meses para la quimioterapia) (Shaw 2013).10
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Se ha desarrollado una nueva generación de inhibidores de ALK, y estos inhibidores se están
estudiando en ensayos clínicos continuamente. En cuanto se detectan nuevos reordenamientos
del gen, se ponen en marcha ensayos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): la
secuenciación para detectar los genes de fusión. Además, los estudios de varias instituciones han
demostrado que la proteína ALK puede ser detectada por inmunohistoquímica (IHC) con amplifi-
cación de la señal en casi todos los tumores que son ALK positivo en FISH, y varios informes describen
casos en que los tumores CPCNP que albergan patrones atípicos de ALK en FISH (FISH ALK negativo)
que son ALK positivo en la IHC pueden responder al tratamiento con inhibidores de ALK (Peled 2012).
En este contexto se están desarrollando y validando los kits comerciales de la IHC actualmente.
El desarrollo de estas múltiples plataformas de diagnóstico proporciona métodos alternativos
para que los laboratorios detecten reordenamientos del gen ALK o proteínas de fusión, depen-
diendo de la experiencia y el equipo técnico disponible. Es necesario estandarizar estos ensayos
dado que las pruebas de diagnóstico clínico requieren ensayos con una sólida reproducibilidad y
fiabilidad. Para abordar esta cuestión, el Comité de Patología de la Asociación Internacional para el
Estudio del Cáncer de Pulmón (IASLC) convocó a un panel de expertos para publicar esta guía que
puede ayudar a los patólogos, científicos de laboratorio y médicos en ejercicio a entender mejor el
trasfondo, el protocolo y la interpretación de los resultados de las pruebas de ALK en pacientes con
CPCNP avanzado.CAPÍTULO 1
Candidatos para las pruebas de ALK
Por Fred R. Hirsch, Elisabeth Brambilla y Ming Sound Tsao
Es ampliamente reconocido que la detección de reordenamientos del gen ALK es importante para la
selección de la mejor terapia para los pacientes con CPCNP avanzado. Sin embargo, no está claro si
las características clínico-patológicas pueden ayudar a determinar qué pacientes deben someterse
a las pruebas de ALK. Los reordenamientos del gen ALK se encuentran con mayor frecuencia en
los tumores de pulmón de los no fumadores,
ex fumadores ocasionales, los pacientes
más jóvenes y en los tumores clasificados A CPCNP-Otros
(n=376)
ADSC (n=78)
como adenocarcinomas. Pero, ¿es plausible
excluir a los pacientes de edad avanzada y
CCE
fumadores con histología escamosa de las (n=1411) CPCNP
pruebas de ALK? En estudios publicados, (n=4025)
alrededor del 70 % al 80 % de los pacientes
con CPCNP ALK- positivo han sido siempre no
fumadores (comparado con el 20 % y el 30 % ADC
(n=6775)
de los fumadores actuales o ex fumadores),
y han sido más jóvenes (40 a 50 años) que
las personas con CPCNP en general (60 a 70
años) o personas con CPCNP con mutación
B 11.1
en EGFR (60 a 65 años) (Rodig 2009). Sin 9
embargo, en todos los estudios, también se 5.2 5.7
4.8
han encontrado tumores que albergaban
reordenamiento de ALK en pacientes mayo- 1.3
res de 70 años o menores de 40. CPCNP ADC ADC CCE ADSC CPCNP-
De acuerdo con estos datos, no está (no seleccionado) (seleccionado) Otros
claro que los antecedentes de tabaquismo Figura 1. Resumen de los estudios sobre el reordenamiento del
y la edad debieran excluir las pruebas ALK gen ALK en CPCNP. A. Número de casos de CPCNP que han sido
en ningún paciente. La histología parece estudiados sobre la aberración ALK y descritos en la literatura
hasta mayo de 2013. “CPCNP” se refiere a los casos de los estudios
ser el criterio de selección más importante. que no especificaron los tipos de tumores, y los “CPCNP-otros”
De entre las más de 12.000 muestras de incluyen carcinoma adenoescamoso (ADSC) y carcinoma de
cáncer de pulmón que se han descrito en células grandes/ sarcomatoide. B. Tasa estimada de casos ALK-
positivo según la histología del tumor. Para adenocarcinoma
la literatura, los reordenamientos de ALK se (ADC), la figura 1 muestra la prevalencia en los estudios con o
encuentran principalmente en los carcino- sin criterios clínicos de selección (por ejemplo, antecedentes de
tabaquismo, negativo en EGFR o mutación en KRAS). Las cifras se
mas no neuroendocrino y no escamoso de basan en datos que se presentan en el Anexo 1. CCE=carcinoma
pulmón. (Figura 1; Anexo 1). Según estos de células escamosas.12
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
datos, varias guías publicadas, incluyendo la guía de más reciente publicación desarrollada por
el Colegio Americano de Patólogos (CAP)/Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de
Pulmón (IASLC)/Asociación para la Patología Molecular (AMP), han recomendado que las pruebas
de ALK no se realicen de forma rutinaria en el CPCNP avanzado con histología escamosa (Lindeman
2013). (Véase el Anexo 2 y el capítulo 9 para una discusión completa de las líneas de actuación para
las pruebas de ALK). Sin embargo, el reordenamiento de ALK se ha detectado en aproximadamente
el 1,3 % de más de 1.400 carcinomas de pulmón de células escamosas (Anexo 1) y en varios informes
de casos en los que el reordenamiento de ALK se verificó mediante la IHC (Alrifai 2013, An 2013,
Ochi 2013). La discordancia entre los estudios de carcinoma de pulmón de células escamosas puede
ser causada por las dificultades que todavía existen para diagnosticar los subtipos histológicos de
CPCNP. Un diagnóstico de cáncer de pulmón a menudo se hace de acuerdo con el examen de una
pequeña muestra de biopsia o muestras citológicas, pero los diagnósticos histopatológicos realizados
en pequeñas muestras de biopsia no siempre son representativos de todo el tumor. En la revisión
de un diagnóstico de cáncer de células escamosas de especímenes que no mostraban evidencia de
mutaciones en EGFR ni mutaciones en KRAS, se demostró la presencia de componentes de adenocar-
cinoma en 15 de 16 tumores (Rekhtman 2012). Por lo tanto, la guía CAP/IASLC/AMP sugiere que las
pruebas de ALK se hagan sólo a los pacientes con adenocarcinoma y cáncer de pulmón mixto con
un componente de adenocarcinoma en muestras de cáncer de pulmón completamente extirpadas.
La prueba ALK también se recomienda para muestras limitadas, como las muestras de biopsia y de
citología, cuando no se puede excluir por completo el componente de adenocarcinoma.
La detección de ALK con la IHC podría ser una solución ideal para los problemas de las pruebas
de ALK en el carcinoma de pulmón de células escamosas. Teniendo en cuenta su bajo coste y su alta
reproducibilidad, sensibilidad y especificidad, las pruebas de IHC se conciben para los pacientes con
carcinoma de pulmón de células escamosas en combinación con la prueba FISH, que es más cara,
y que se utiliza para confirmar los resultados positivos de la IHC.
Las pruebas para el reordenamiento del ALK no se asocian actualmente con resultados terapéu-
ticos inmediatos en los pacientes con CPCNP localizado o loco-regional. Sin embargo, pueden ser
beneficiosas ya que muchos de estos pacientes, posteriormente, pueden sufrir una recidiva, y los
resultados de las pruebas podrán ahorrar tiempo y esfuerzo en el futuro.CAPÍTULO 2
Obtención de muestras, procesamiento y
diagnóstico general de procedimientos
Por Keith M. Kerr, Ignacio Wistuba y Yasushi Yatabe
Las pruebas para detectar reordenamientos del gen ALK (en muestras de tejido afectadas por cáncer
de pulmón) es uno de los varios procedimientos de diagnóstico necesarios. En la mayoría de los
pacientes, un único procedimiento de muestreo va a generar una cantidad relativamente pequeña
de tejido que luego debe ser utilizado de la manera más eficiente para permitir el diagnóstico más
completo posible. Deben tenerse en cuenta dos puntos importantes sobre muestras de tejido:
existe la posibilidad de que una muestra no contenga tejido tumoral, y sólo hay una oportunidad
de fijar y procesar el tejido. Por lo tanto, la adquisición y el procesamiento son pasos cruciales en el
control de calidad con el fin de facilitar todos los procedimientos de diagnóstico que se necesiten
hacer sobre una muestra de tejido.
La obtención de tejido para el diagnóstico
En la mayoría de los casos, las pruebas de ALK se realizan en una pequeña muestra de tejido obtenida
por biopsia o en muestras citológicas tomadas de los pacientes con enfermedad avanzada. Con
menos frecuencia, se encuentra disponible todo el tumor de un paciente al que se le practicó una
resección quirúrgica de la enfermedad en etapa inicial y recurrencia posterior. La toma de muestras de
tejido para el diagnóstico debe tener como objetivo la obtención del mayor rendimiento del tumor
en la forma más segura y menos invasiva posible (Thunnissen 2012d). El muestreo puede implicar
al tumor primario, la enfermedad metastásica intratorácica o metástasis extratorácica. Aunque se
han descrito discrepancias en el estado de ALK entre la enfermedad primaria o metastásica (Kim
2013), no hay suficientes datos para recomendar ningún método en concreto para la obtención
de tejido. El tumor primario puede ser muestreado con endoscopia (por biopsia endobronquial o
transbronquial, criobiopsia o punción aspiración con aguja fina [PAAF]), o con una técnica percutánea
transtorácica (por biopsia con aguja o PAAF). Hoy en día la enfermedad metastásica intratorácica
es rutinariamente muestreada usando ultrasonido endobronquial (EBUS) o una ecografía trans-
esofágica (USE). Normalmente la enfermedad pleural (ya sea biopsia pleural o citología del líquido)
es una buena fuente de material diagnóstico. La enfermedad metastásica distante (extratorácica)
se puede muestrear dependiendo de su procedencia; en todos los casos, varias técnicas de imagen
son útiles para determinar la selección de las muestras para mejorar el rendimiento del tumor
(Rivera 2007). En muchos de los centros, se utilizan procedimientos quirúrgicos para obtener tejido
si no se obtiene el material suficiente con los procedimientos guiados por imagen o cuando dichos
procedimientos no han tenido éxito.
Tejido para la prueba de ALK
Para la prueba de ALK se puede utilizar tanto la biopsia de tejido como las muestras procedentes14
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
de citología; la clave está en que el material debe ser procesado y manipulado de forma adecuada
y la muestra debe contener suficientes células tumorales (Thunnissen 2012b). El número de células
tumorales necesarias para la determinación inmunohistoquímica (IHC) de la proteína ALK aún no
está definido, pero para evaluar la técnica FISH para determinar el reordenamiento del gen ALK, se
requiere un mínimo de 50 células tumorales. Existen diferentes enfoques para las muestras de frotis
citológico, pero el más adecuado con las muestras de citología es generalmente el bloque celular
que permite preparar y tratar las secciones de la misma manera que las secciones de muestras de
biopsia de tejido. En general, todo el tejido o material celular recibido en el laboratorio de patología
debe ser procesado. Los especímenes de resección quirúrgica son una excepción, aunque, como
regla general, los tumores con un diámetro de 3cm o menos deben ser procesados en su totalidad.
Los derrames pleurales abundantes también pueden ser procesados en parte. Se recomienda el
almacenamiento del fluido hasta que todos los procedimientos de diagnóstico hayan concluido.
Procesamiento de tejidos
Se recomienda la fijación por inmersión, o cuando corresponda, por insuflación, con formaldehído
tamponado al 10%. La pre-fijación con algunos fijadores a base de alcohol puede alterar la anti-
genicidad del tejido o la integridad del DNA. Las soluciones descalcificadoras ácidas utilizadas en
muestras de biopsia ósea pueden interferir con la IHC, con frecuencia comprometer la prueba FISH y
a menudo degradar el DNA, y por ende hacer que las pruebas para determinar las mutaciones sean
menos fiables. También se deben evitar los agentes de fijación que son ácidos (tales como el fluido
de Bouin) o a base de sales de metales pesados. En general, se recomienda un periodo de fijación
de más de 6 horas y menos de 48 horas, especialmente cuando se tengan que hacer pruebas de
biomarcadores (para las que la integridad del DNA es importante) (Wolff 2007, Hunt 2007).
Un defecto o un exceso de fijación pueden tener efectos nocivos en el DNA y sobre los epíto-
pos de una proteína antigénica (Werner 2000, Atkins 2004, Oyama 2007, Bussolati 2008, Eberhard
2008). Una de las partes importantes de dicha fase en la manipulación de tejidos es el periodo de
tiempo que comienza inmediatamente después de extirpar la muestra del paciente y colocarla
en el fijador. La mayoría de los laboratorios no tienen ni el control, ni los datos sobre la cantidad
de tiempo transcurrido entre la extracción de tejidos y la inmersión en un fijador y su llegada al
laboratorio. Además, la mayoría de las máquinas de procesamiento de tejidos tienen una etapa de
fijación, lo que aumenta el tiempo de fijación. En la práctica, la mayoría de los laboratorios ajustan
sus procesos de tinción pertinentes para la IHC y la hibridación in situ (ISH) para determinar su
propio tiempo medio de fijación. La determinación de la naturaleza y duración de la fijación es un
desafío aún mayor en los laboratorios que reciben muestras de muchas fuentes externas con muy
diferentes métodos de fijación.
Manejo de tejidos para pruebas de biomarcadores
La mayoría de las investigaciones con biomarcadores (IHC, ISH, o estudios de RNA / DNA) se llevan
a cabo durante el estudio diagnóstico inicial. En estas circunstancias, se deben utilizar las secciones
recién cortadas para las pruebas de biomarcadores. El tejido previamente cortado y almacenado en
un portaobjetos se deteriorará en cuestión de días o semanas y, ciertamente, a lo largo de los meses.
La degradación depende de las condiciones de almacenamiento y muy probablemente también del
biomarcador específico (Atkins 2004). La estabilidad de la proteína ALK en secciones no teñidas aún
no se ha estudiado sistemáticamente. Por lo tanto, de forma similar que en la determinación de HER2
en cáncer de mama, los cortes de secciones de tejido almacenadas durante más de 6 semanas no
se deben utilizar para las pruebas de IHC para ALK. Si se requiere su almacenamiento, las secciones15
CAPÍTULO 2: Obtención de muestras, procesamiento y diagnóstico general de procedimientos
deben estar revestidas en cera o un medio similar para evitar la oxidación por aire y además deben
mantenerse en un lugar fresco, oscuro y seco. El tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE)
es menos propenso al deterioro, y en la mayoría de las circunstancias, resulta útil recortar el bloque
de tejido según sea necesario en un momento posterior. Existen diversas estrategias que pueden
ayudar a limitar el número de veces que el bloque debe ser cortado para proporcionar material para
la evaluación inicial morfológica, la tinción IHC, y posterior análisis molecular. Por ejemplo, las sec-
ciones adicionales se pueden cortar en la primera sesión de corte, y aunque esta estrategia puede
salvar la inevitable pérdida de material de gran valor en cada nueva sesión de corte, se puede dar
el caso de cortar innecesariamente y ello puede plantear cuestiones relacionadas con el almace-
namiento de las secciones cortadas (Figura 1).
El
Procedimiento rutinario actual
Tinción con H&E para
diagnóstico histológico
Repetir cortes
para la IHC
Repetir cortes
para las
pruebas
moleculares
El procedimiento en la era de las terapias molecularmente dirigidas
Tinción con H&E para
diagnóstico histológico
para la IHC
para las pruebas
moleculares
Figura 1. Preparación de las secciones de tejido durante la evaluación diagnóstica. La práctica rutinaria actual consiste en
hacer secciones adicionales para el ensayo IHC y/o pruebas moleculares después de los cortes iniciales para la tinción de
hematoxilina- eosina (H&E) para el diagnóstico histológico. El corte seriado múltiple puede mermar el volumen del tumor cada
vez que se recorte el bloque. En la era de las terapias molecularmente dirigidas, la preparación de las secciones adicionales
sin teñir para posibles análisis de IHC y/o pruebas moleculares puede reducir significativamente la cantidad de muestra de
tejido perdido y mejorar el tiempo de respuesta.16
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
primer paso en la evaluación de una muestra es identificar la presencia o ausencia de malignidad.
Dependiendo de la selección de pacientes, elección de la técnica de muestreo y la habilidad del
cirujano, la tasa de hallazgos tumorales positivos es generalmente alta, pero puede variar desde
aproximadamente el 60 % hasta más del 90 % (Schreiber 2003). Es bien sabido que, incluso cuando el
tumor está presente en la muestra, puede no estar presente en todos los fragmentos de tejido y por lo
general comprende una pequeña proporción de la muestra (Coghlin 2010). Una vez que se confirma
la malignidad, el siguiente paso es excluir la posibilidad de tumores malignos no epiteliales (tales
como linfoma o sarcoma) y/o la posibilidad de que un cáncer, especialmente el adenocarcinoma,
no sea la metástasis de pulmón de otro órgano (Kerr 2013b). Este paso se suele hacer fácilmente
basándose en la evaluación de la información clínica y radiográfica adecuada que acompaña a
la muestra y la evaluación morfológica básica basada en H&E. La falta de información clínica, sin
embargo, puede conllevar a la realización de pruebas auxiliares de IHC innecesarias en la muestra
en un intento de excluir posibles fuentes extratorácicas de un adenocarcinoma, lo cual puede con-
llevar a que se agote el material para posteriores estudios moleculares.
Suponiendo que el tumor es un cáncer primario de pulmón, el siguiente paso es distinguir el
cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) de otros tipos, ya que el CPCP avanzado se trata de
manera distinta al CPCNP. Por lo general, esta discriminación se puede hacer con gran precisión
basándose en las características morfológicas (Burnett 1994), pero aún así, la IHC podría llegar a
ser necesaria. La mayoría de los casos que no son CPCP pueden ser diagnosticados con precisión
y clasificados morfológicamente como carcinomas escamosos, adenocarcinomas o, en raras oca-
siones, otro tipo de CPCNP. Entre 25% y 40% de los casos, sin embargo, dependiendo del tipo de
muestra y casuística, las características morfológicas no son adecuadas para la clasificación precisa
y consistente del subtipo CPCNP; tales casos deben ser designados inicialmente como CPCNP no
especificado (NOS) (Chuang 1984). A continuación, se puede utilizar la IHC en el diagnóstico para
predecir la probabilidad del subtipo de CPCNP (Loo 2010, Travis 2011, Travis 2013). Este enfoque,
utilizando un panel de IHC limitado, puede reducir la proporción de casos de CPCNP-NOS a menos
del 10% y predecir el subtipo de CPCNP en la mayoría de los casos de NOS con una precisión de
más del 80% (Loo 2010). Los casos descritos juntamente con este uso de IHC deben ser informados
usando la terminología recomendada (por ejemplo, CPCNP, probable adenocarcinoma) en un caso
morfológicamente indiferenciado, donde la IHC puede predecir adenocarcinoma (Travis 2011, Kerr
2013a).
Conclusión
El criterio estándar se basa en la identificación de pacientes con dianas moleculares terapéuticas
en sus tumores. La necesidad de más pruebas moleculares, más allá de las requeridas para el diag-
nóstico morfológico inicial y el perfeccionamiento de la clasificación de tumores por la IHC cuando
sea necesario, hace que la adquisición, la manipulación, el procesamiento y el aprovechamiento
razonable de tejido tumoral de diagnóstico sea de suma importancia. Se debe hacer todo lo posible
para asegurar que una cantidad suficiente de tejido tumoral esté disponible para los pasos diagnósti-
cos posteriores. Sin embargo, la falta de tejido suficiente puede ser inevitable en algunos casos, y
conlleva a un gran impacto en las pruebas moleculares que siguen al diagnóstico del tumor. Cuando
la cantidad de tejido es insuficiente, es cada vez más frecuente realizar la biopsia de repetición.CAPÍTULO 3
Hibridación In Situ Fluorescente (FISH)
Por Akihiko Yoshida y Marileila Varella-Garcia
La sonda FISH de rotura (o break-apart) fue originalmente desarrollada para la detección de fusio-
nes de genes creados por translocaciones intracromosomales. FISH break-apart es un método de
diagnóstico fiable en la patología quirúrgica, ya que es fácilmente aplicable a especímenes FFPE,
incluso cuando no se conocen las parejas exactas de fusión. Las sondas FISH ALK break-apart se han
incorporado con éxito en la práctica habitual de diagnóstico de linfomas y de los tumores mesen-
quimales, y el descubrimiento del reordenamiento de ALK en un subgrupo raro de CPCNP amplió
su aplicación (Soda 2007). Sin embargo, en este último escenario, la prueba FISH se ha enfrentado
a complicaciones inesperadas, principalmente debido a que las variantes comunes de fusión se
producen entre ALK (2p23.2) y el gen situado muy cerca de EML4 (2p21) a través de inversiones
intracromosomales. Rara vez el gen ALK se fusiona con otros genes por translocación intracromo-
somal. Por lo tanto, la técnica FISH break- apart para detectar el reordenamiento del gen ALK, se debe
realizar prestando mucha atención a los aspectos técnicos y a la interpretación de los resultados.
Diseño de la sonda FISH
La sonda de rotura ALK está originalmente diseñada mediante el marcaje de la región 3' (telomérica)
del punto de rotura con un fluorocromo y la región 5' (centromérica) con otro fluorocromo distinto.
Existen algunas variaciones entre los diferentes reactivos comerciales o hechos a medida para las
zonas genómicas específicas cubiertas por las sondas y los distintos fluorocromos utilizados para el
marcaje. En el kit desarrollado por Abbott Molecular (Figura 1; Vysis LSI FISH ALK break apart Probe
Kit), la región 3' (aproximadamente de
300 kb) se representa por una señal 300 kb 442 kb
naranja (espectro naranja, a menudo 3' 5'
referido como rojo en la literatura 2p23.2
debido a que la señal es detectada por ALK EML4
el filtro de interferencia en la longitud
de onda roja), y la región 5' (aproxima- Normal
damente de 442 kb) está representada
~12.5 Mb inversión
por una señal verde (espectro verde). Gen de fusión EML4- ALK
Este conjunto de sonda fue aprobado ALK:EML4
como un ensayo de diagnóstico com-
ALK:EML4
plementario para un inhibidor de
ALK por la FDA de EE.UU. y se utiliza
Figura 1. El Vysis LSI FISH ALK Break Apart Probe Kit (Abbott Molecular)
comúnmente en todo el mundo. para la prueba para detectar la presencia del gen de fusión EML4-ALK (reor-
denamiento en ALK) en el cáncer de pulmón.18
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Requisitos de manipulación preanalítica
Como cualquier ensayo basado en el DNA, la técnica FISH tiene una ventaja importante por su
solidez. Sin embargo, el ensayo se ve afectado por muchos factores, especialmente el momento de
la fijación, el tiempo de fijación, y el tipo de fijador, todo lo cual puede conducir a la degradación
del DNA (Tabla 1) (Hunt 2007, Babic 2010). Por ejemplo, la larga isquemia fría, o que transcurra más
de 1 hora desde el momento en que el tejido se extirpa hasta que se fija, puede provocar la degra-
dación del DNA y por consiguiente que las pruebas de FISH no sean valorables (Khoury 2012). Se
considera que el momento ideal para la fijación es de entre 6 y 48 horas (Hunt 2007, Babic 2010);
tanto los tiempos de fijación más cortos como los más largos pueden influir en el rendimiento de
las pruebas de manera significativa.
Tabla 1. Recomendaciones preanalíticas para la obtención de unos buenos resutados de las pruebas FISH
Parámetro Recomendaciones
Tiempo de fijación Lo más corto posible, que no exceda 1 hora
Fijador Formaldehído tamponado al 10%
Tiempo de fijación 6-48 horas
Preparación Muestras parafinadas cortadas a un grosor de 5 ±1 μm
Almacenamiento de la muestra Bloques de tejido (ideal)
Tiempo de almacenamiento de
No es relevante si las condiciones son adecuadas
los bloques
Condiciones de almacenamien-
Protegidos de la luz, del calor y la humedad
to de los bloques
Tiempo de almacenamiento 4-6 semanas (ideal); los cortes menos recientes requieren un
para los cortes histológicos protocolo personalizado
Descalcificación EDTA, si es necesario
El fijador óptimo es el formaldehído tamponado al 10%; el fijador Prefer y el fijador de Bouin
impedirán la hibridación. Es casi seguro que los tejidos descalcificados con soluciones de ácido fuerte
no puedan hibridar. La descalcificación suave con EDTA o ácido fórmico en general no afecta sustan-
cialmente el rendimiento de la prueba. La descalcificación es particularmente relevante cuando la
única muestra disponible para el análisis molecular es una lesión ósea metastásica; en tales casos,
el grado de descalcificación ósea puede deducirse a partir del tejido teñido con H&E, lo cual puede
ayudar a decidir si se pueden utilizar las muestras para la prueba FISH.
Otro factor relevante para la eficacia del ensayo es el tiempo y las condiciones de almacenamiento
de las secciones. El tejido seccionado en portaobjetos que se guarda durante un periodo prolongado
a temperatura ambiente no suele dar buenos resultados en ensayos FISH estándar, requiriendo
protocolos personalizados. Por lo tanto, el bloque de tejido incluido en parafina es el formato ideal
de almacenamiento. El tiempo de almacenamiento aceptable para los bloques de parafina varía en
función de las condiciones de almacenamiento (por ejemplo, la temperatura, la exposición a la luz,
al calor o a la humedad), y los materiales sometidos a condiciones que degradan el DNA pueden
fallar para hibridar.
Numerosas variables antes y después de la hibridación también pueden afectar a la prueba. El
proceso de prehibridación incluye una serie de pasos para facilitar la penetración de la sonda en el
núcleo de las células tumorales. La permeabilización del tejido se consigue con la digestión de las19
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
grandes estructuras de proteínas, pero no todas las muestras responden de forma idéntica a un deter-
minado protocolo. Los tumores pobremente diferenciados son más sensibles a los procedimientos
de prehibridación, mientras que los tumores mucinosos y fibrosos son más resistentes. Los lavados
post-hibridación deben permitir la eliminación adecuada de la sonda no hibridada sin disminuir la
intensidad de la señal. Muchos protocolos alternativos pueden generar excelentes resultados, por
lo que los laboratorios pueden elegir cualquiera de estos protocolos mientras las condiciones se
ajusten adecuadamente a las características de la muestra.
Evaluación de la calidad de las muestras hibridadas y selección de
células valorables
Es esencial que la calidad de la mor-
fología del tejido y la intensidad de la
señal sean evaluadas rigurosamente
antes de aceptar una muestra para el
análisis. Las muestras son óptimas para
el análisis cuando presentan una mor-
fología excelente y una intensidad de
señal con muy baja tinción de fondo
(Figuras 2 y 3). Las muestras con una
digestión excesiva de la cromatina o
escasa penetración de la sonda no son A
aceptables y deben ser analizadas de
nuevo cuando se hayan solucionado
los problemas técnicos. Por ejemplo, las
muestras no son aceptables cuando el
pre-tratamiento de los tejidos es insu-
ficiente o excesivo (Figura 4) o cuando
la superposición de núcleos con señales
fusiformes, producto del artefacto en
B C
los cortes, hace imposible valorar la
Figura 2. Campos microscópicos de los tumores de pulmón ALK negativo.
D
A B C E
Figura 3. Campos microscópicos de los tumores de pulmón ALK positivos mostrando principalmente el patrón dividido
3'-5' (3A-3C) y el patrón aislado 3' (3D, 3E).20
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
separación entre la señal roja y
la verde (Figura 5).
El reordenamiento de ALK
aparece homogéneamente distri-
buido en el tumor, lo que refleja
su papel oncogénico crítico
(Camidge 2010). Por lo tanto, no
es necesario seleccionar un área
del tumor específico basado en la
morfología o perfil inmunológico,
y en cambio se recomienda cla-
sificar varias áreas tumorales
diferentes. La gradación de los A B
tumores se debe realizar en Figura 4. Muestras no aceptables para el análisis debido a la digestión excesiva
las células tumorales muy bien del tejido (4A) o la escasa digestión del tejido (4B).
conservadas que no se solapan
y que tienen por lo menos una
copia de cada una de las señales
de las regiones 5' y 3'. Debido a
que el cáncer de pulmón tiende
a asumir una amplia gama de
patrones de crecimiento, y
porque las células tumorales
pueden mezclarse estrecha-
mente con los elementos de
tejido no tumoral (por ejemplo,
macrófagos alveolares y linfoci-
tos), la identificación precisa de
las células tumorales puede ser A B
difícil en un campo oscuro. Es Figura 5. Muestras no aceptables para el análisis debido a altos niveles de
recomendable remitirse siempre tinción de fondo (5A) y señales fusiformes (5B).
a una serie de cortes histológicos de tejido teñido con H&E para el ajuste morfológico adecuado.
Clasificación celular: patrones de señal
Conceptualmente, las zonas genómicas homólogas a las sondas 5' y 3' están molecularmente muy
cercanas y estas señales se visualizan como fusionadas, próximas o adyacentes en las células nor-
males. Por el contrario, cuando el gen de fusión EML4-ALK está presente, la señal verde de 5' ALK se
aleja bastante de la señal roja de 3' ALK (aproximadamente 12,5 Mb), y las señales se ven como si estu-
vieran divididas. En realidad, las señales 3' y 5' se pueden visualizar o muy alejadas o muy próximas
entre sí en las células huéspedes tumorales anormales debido a diversos grados de condensación
y reordenamientos tridimensionales de la cromatina. Del mismo modo, debido a la proximidad
de EML4 y ALK, la división puede ser tan estrecha que las señales pueden parecer fusionadas en el
reordenamiento ALK (Figura 6). Además, esta región genómica parece ser altamente inestable, y las
regiones homólogas a una de las sondas se pueden perder, y por consiguiente, la señal correspon-
diente también. Como resultado, cada célula tumoral puede mostrar una variedad de combinaciones
de señales de co-localización 5'-3' ALK o señales aisladas de 5' o 3' ALK.21
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
A pesar de esta diversidad
CLASIFICACIÓN DE LA SEÑAL
en el perfil de la señal, las célu- Patrones observados en ALK nativo Patrones observados en patrón
las se pueden clasificar dentro dividido 3'-5' ALK
de cuatro patrones distintos
basados según el número de
la señal y su localización.
Rojo y verde Rojo y verde Rojo y verde Rojo y verde
separado por separado por separado por separado por
Patrón fusionado (normal) diámetros de diámetros de diámetros de diámetros de
(Figura 7A). Se considera que señal22
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Patrón aislado 5' (negativo) (Figura 7D). Se considera que una célula tiene un patrón aislado 5'
cuando sólo están presentes señales aisladas 5' y no hay señales aisladas 3'. Cuando una célula tiene
tanto señales aisladas de 3' como 5', con más señales de 5' que de 3', la clasificación correcta es la
de patrón dividido, y no de patrón aislado 5'. El número de señales fusionadas acompañantes no es
relevante para la clasificación de patrones.
Nota: Los criterios para el patrón dividido se basan principalmente en las pruebas efectuadas de
las secciones del tumor FFPE con el Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, y los criterios deben
ser validados cuando se utiliza un reactivo analítico diferente o un espécimen biológico. El tamaño
de la sonda puede diferir entre los diseños de sonda, y una sonda más grande da como resultado
tanto un tamaño de la señal más grande como una distancia más corta necesaria para la definición
de patrón dividido.
señal señal señal
Célula Pattern
fusionada 5' 3'
Gradación de tumores
Se necesita un mínimo de 50 células tumorales Célula 1 2 0 0 Fusionada
cuando hay un marcador y un mínimo de 100 Célula 2 2 1 1 Dividida
células tumorales cuando hay dos marcado- Célula 3 2 0 1 Aislada 3'
res (ver más información en la sección “Valor Célula 4 1 1 0 Aislada 5'
de Corte”). Las muestras con menos células Célula 5 0 1 2 Dividida
evaluables no son adecuadas para el análisis Célula 6 1 0 0 Fusionada
FISH (Camidge 2010). El patrón de señal de cada
Célula 50 2 0 0 Fusionada
célula tumoral se debe anotar en una hoja de
Resumen de gradación de células:
registro (Figura 8). Es probable que la gradación Número total de células contadas: 50
de tumores sea más exacta cuando se visua- Número total de células con patrón fusionado: 19
Número total de células con patrón dividido: 22
liza el tejido bajo un microscopio con filtros de Número total de células con patrón aislado 3': 5
interferencia individuales (rojo y verde) y dual. Número total de células con patrón aislado 5': 4
Número total de células con patrón de reordenamiento positivo: 22+5=27
La gradación de tumores basada en imágenes Tasa de células de reordenamiento positivo: 27÷50 x100=54%
capturadas tiene limitaciones y la imagen debe Figura 8. Un ejemplo de una hoja de registro de gradación
representar toda la profundidad de la sección de células.
con el fin de evitar una falsa
interpretación de las señales
aisladas (Figura 9).
El aumento de copias del
gen ALK nativo es común en
CPCNP (Figura 10) y no existe
ningún indicio de que esté
asociado con la sobreexpre-
sión de la proteína. Hoy por
hoy, no se recomienda que
el número de copias de ALK
se incluya de forma rutinaria
como parte de la gradación. 16 planes at 0.4 µm=
A No z-stacking B 6.4 µm z-stacking
Nota: El tamaño de la señal
Figura 9. El análisis basado en imágenes capturadas es difícil si la sobreposición
en las imágenes capturadas z (consolidación de múltiples niveles de enfoque en un plano) no representa toda
tiende a ser ligeramente más la profundidad de la sección.23
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
D
A B C E
Figure 10. El aumento de número de copias de las señales de ALK nativas aumenta comúnmente en muestras de cáncer de
pulmón, con niveles que van desde bajo (10A) a muy alto (10C). Un grupo de numerosas copias sugiere la amplificación del
gen (10D, 10E). El aumento de número de copias no debe ser interpretado como un resultado positivo.
grande que la que se observa en el examen real bajo microscopía de fluorescencia. Cuando la gra-
dación se realiza en las imágenes capturadas, la distancia entre las señales puede subestimarse, lo
que puede comprometer los resultados del análisis.
Otro riesgo en la utilización de imágenes capturadas para la gradación de tumores es que la
captura de imágenes a menudo consolida múltiples niveles de enfoque en un plano, y, como resul-
tado, una señal dividida verticalmente a lo largo del eje z del plano de tejido puede no distinguirse
de una señal fusionada.
Clasificación de la muestra: tasa de células de reordenamiento positivo
La tasa de reordenamiento positivo se define como:
Tasa de reordenamiento de células positivas (%) = [(número de células con patrón dividido + número
de células con patrón aislado 3’) / Número total de células evaluadas] × 100
Nota: Debido a que el dominio cinasa de la tirosina cinasa del ALK se codifica en la región 3' del gen,
la señal 3' no apareada es la que indica el gen de fusión oncológicamente relevante, mientras que
la señal no apareada 5' representa probablemente un producto de fusión recíproco no funcional.
Por lo tanto, las células con un patrón aislado 3’ se clasifican como células de reordenamiento posi-
tivo junto con las que tienen un patrón dividido. Las células con un patrón aislado 5' no deben ser
interpretadas como células de reordenamiento positivo. Si no tenemos en cuenta el patrón aislado
3' y nos limitamos a la definición de reordenación para el patrón dividido, se reduce la sensibilidad
del ensayo de FISH de ALK en un 60% ó 70% (Yoshida 2011a, Paik 2011).
Valor de corte
Debido a que el gen de fusión EML4-ALK se crea normalmente por una pequeña inversión intra-
cromosomal que afecta a dos genes localizados en las proximidades, la distancia entre las señales
de división que supone un reordenamiento de ALK es normalmente estrecha cuando se utiliza la
prueba FISH break-apart. Debido al grado de condensación de la cromatina en las células o su dis-
tribución física, las divisiones estrechas son a veces técnicamente no distinguibles de las señales
fusionadas (Figura 6), lo cual puede causar que la tasa de células con reordenamiento positivo en
ALK en CPCNP sea baja (40 % al 70 %)(Perner 2008, Camidge 2010, Camidge 2012b). Además, CPCNP
sin reordenamiento de ALK puede tener patrones de reordenamiento positivo (es decir, patrón
dividido o patrón aislado 3') en una fracción de células (Perner 2008, Camidge 2010, Yoshida 2011a),También puede leer
