Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis

Página creada Luis Urroz
 
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Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis
Aplicación de los microarrays de DNA al
estudio de la resistencia a isoniazida en
      Mycobacterium tuberculosis
Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis
PNAS, 22: 12833-12838 (1999)
Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis
Tuberculosis

•   La tuberculosis es una enfermedad crónica infecciosa causada
    por Mycobacterium tuberculosis. A pesar del desarrollo de
    vacunas y fármacos, continua siendo una importante causa de
    mortalidad.

•   Tuberculosis y SIDA son las principales causas de muerte por
    enfermedades infecciosas (3 millones/año).

•   Se estima que hay 7 millones de nuevos casos por año.

•   La infección por HIV incrementa la mortalidad por tuberculosis al
    disminuir la resistencia.
Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis

•   Después de varias décadas de retroceso debido al desarrollo de
    fármacos efectivos, la incidencia de la tuberculosis comenzó a
    incrementar a mediados de los 80.

•   Una causa del aumento de la tuberculosis es la aparición de
    cepas de M. tuberculosis resistentes a antibióticos.

•   El creciente problema de la resistencia a fármacos combinado
    con la incidencia global de esta enfermedad pone en evidencia
    la urgente necesidad de nuevas terapias antituberculosas.

•   La pared de M. tuberculosis, cuya integridad resulta esencial
    para la viabilidad de la bacteria, proporciona toda una batería de
    potenciales dianas para el desarrollo de nuevos fármacos.
Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis

•   La primera línea de defensa contra la mayor parte de las
    infecciones bacterianas incluye a los macrófagos, células del
    sistema inmune que fagocitan a las bacterias y las atacan con
    agentes químicos y bioquímicos.

•   El stress oxidativo es parte de la defensa natural del huésped a
    la infección bacteriana.

•   Excepcionalmente, M. tuberculosis está adaptado a sobrevivir
    dentro del macrófago: parte de esta adaptación se debe a su
    pared celular que tiene una baja permeabilidad.

•   La bacteria también realiza cambios sustanciales en los perfiles
    de expresión génica, para adaptarse al estado fisiológico del
    macrófago (bajo pH y stress oxidativo).
Isoniazida (INH)
•   Un fármaco primario utilizado en la prevención y tratamiento de la
    tuberculosis es la isoniazida (hidracida del ácido isonicotínico).

•   La isoniazida ataca a M. tuberculosis al interferir en la síntesis de
    la pared celular, sin la que la bacteria no puede sobrevivir.

•   Evidencias genéticas y bioquímicas indican que las dianas de la
    isoniazida incluye enzimas que participan en la biosíntesis de
    ácidos micólicos (principales componentes de la pared celular):
             • InhA, enoil ACP reductasa
             • KasA, β-cetoacil ACP sintasa

•   Las micobacterias presentan una pared celular muy compleja con
    abundancia de lípidos (algo excepcional en bacterias Gram +).
Pared celular de M. tuberculosis
Ácidos micólicos
•   Los ácido micólicos son α-alquil-β-hidroxiácidos grasos de cadena
    larga (60-90 átomos de carbono) y son los lípidos mayoritarios de
    la pared celular de micobacterias.

•   Los ácidos micólicos están compuestos de una cadena α de
    ácidos grasos lineales saturados de tamaño intermedio (R1=C24-
    C26), y una cadena larga (R2>C50) de ácido meromicólico.

•   La isoniazida bloquea múltiples componentes del sistema FAS-II
    (sistema de la ácido graso sintasa tipo II) que se requieren para
    la completa extensión de la cadena de ácido meromicólico.
Sistema FAS-II

•   En la biosíntesis de las cadenas acil (R1 y R2) de los ácidos
    micólicos intervienen dos sistemas:

         • El sistema FAS-I que lleva a cabo la síntesis de novo de
           ácidos grasos y genera precursores de 14-26 carbonos.

         • El sistema FAS-II actúa sobre los productos de FAS-I
           unidos a AcpM (acyl carrier protein), elongándolos para
           generar ácidos grasos de 24-56 carbonos.

•   A continuación, los ácidos meromicólicos son modificados: un
    meromicolato se condensa con un ácido graso para dar un β-
    oxomicolato, que se reduce para formar el ácido micólico.
Sistema FAS-II
Sistema FAS-II

•   El sistema FAS-II es dependiente de AcpM (acyl carrier protein).

•   Aunque el mecanismo preciso de toxicidad de la isoniazida no ha
    sido descrito, la acción inhibidora de la isoniazida en forma activa
    (INH*) parece ser el resultado del efecto sobre tres dianas en el
    sistema FAS-II: InhA, KasA y AcpM.

•   Por un lado la isoniazida se une al NADH en el sitio activo de
    InhA (enoil ACP reductasa dependiente de NADH).

•   Pero además forma un complejo ternario al unirse
    covalentemente con las enzimas KasA (β-cetoacil ACP sintasa
    encargada de la elongación de los ácidos grasos) y la AcpM (acyl
    carrier protein).
Sistema FAS-II
Resistencia a isoniazida
•   Después de la absorción por la bacteria, la isoniazida se tiene que
    convertir a una forma activa (INH*).

•   La enzima catalasa KatG efectua la activación de la isoniazida y
    está posiblemente implicada en la resistencia antibiótica. Su
    función natural es eliminar peróxidos en situaciones de stress
    oxidativo.

•   La isoniazida es el fármaco más utilizado entre el arsenal de
    fármacos antituberculosos y al que más frecuentemente emerge
    la resistencia.

•   La resistencia a isoniazida emerge frecuentemente debido a
    mutaciones que inactivan KatG.
Detección mediante microarrays de cambios
    en los perfiles de expresión génica
•   La era post-genómica en la investigación y diseño de nuevos
    fármacos antituberculosos se inició a partir de la secuenciación
    del genoma de M. tuberculosis H37Rv.

•   Esto hizo posible el primer abordaje genómico a la biología de
    este patógeno y al estudio de la resistencia a fármacos.

•   Objetivo: Examinar cambios en la expresión génica de cepas de
    M.tuberculosis susceptibles y resistentes durante la exposición a
    fármacos (isoniazida y etionamida).

•   Aunque previamente se habían realizado estudios bioquímicos
    que implicaban a algunas proteínas en la resistencia, se llevó a
    cabo un estudio general para identificar el mayor número de
    posibles dianas para fármacos antituberculosis.
Detección mediante microarrays de cambios
    en los perfiles de expresión génica
•   La etionamida está relacionada estructuralmente con la isoniazida
    y se utiliza como antibiótico de segunda linea.

•   A diferencia de la isoniazida, no tiene el requerimiento de la
    activación mediada por KatG.

•   Isoniazida y etionamida inhiben la biosíntesis de ácidos micólicos
    y tienen como dianas las mismas enzimas del sistema FAS-II.

•   Hipótesis: la etionamida genera un perfil similar de respuesta
    génica que la isoniazida en M. tuberculosis.
Microarray de DNA de M. tuberculosis H37Rv

•    Amplificación con primers específicos de cada ORF, tamaño de
     los amplicones: 200-1000 bp.

•    Impresión robótica en portas recubiertos de polylisina.

•    Control DNAs: DNA genómico total y DNA ribosómico.

•    Construcción de 3 series de microarrays:

      • Version completa: 3.834 ORFs del total de 3.924 ORFs (97%).

      • Versiones reducidas: 203 ORFs seleccionadas conteniendo
        genes que codifican enzimas lipogénicas o lipolíticas (29%).
Perfiles de expresión génica con un Microarray de DNA

Preparar Microarray
                                         Purificar          Impresión
Clones DNA            PCR
                                        productos            robótica

Aislar RNA y marcaje
        Muestra A              Aislar            Marcaje con Cy5
                               RNA

        Muestra B              Aislar
                               RNA               Marcaje con Cy3

Mezclar, hibridar sondas y analizar datos

Hibridación
                      Lavado                                Analizar datos
microarray
Proceso para el análisis de microarrays de DNA
Cepa M. tuberculosis sin fármaco                 Cepa M. tuberculosis con fármaco

                                   Crecimiento           Tratamiento con fármaco:
                                   en medio 7H9              INH o Etionamida

                                   Aislamiento RNA

          Marcaje con Cy3-dUTP                       Marcaje con Cy5-dUTP

                            Combinar los dos cDNAs

                          Hibridación, 63°C, 4-6 h

                                      Lavado

                                    Escaneado
Proceso para el análisis de microarrays de DNA

•   Cultivos líquidos de M. tuberculosis en fase de crecimiento
    exponencial.

•   Toma de muestras bacterianas a intervalos definidos durante las
    8 primeras horas de tratamiento con el fármaco.

•   Marcaje cDNAs:
            • Inicio de tratamiento: t = 0, marcaje con Cy3
            • Resto de intervalos(20 min, 40 min, 1 h, 4 h, 8 h):
              marcaje con Cy5

•   Para cada intervalo de tiempo, los dos cDNAs marcados
    (Cy3/Cy5) se mezclaron e hibridaron con el microarray de DNA de
    M. tuberculosis H37Rv.
Detección mediante microarrays de cambios
    en los perfiles de expresión génica

 •   M. tuberculosis 1254: cepa sensible a isoniazida y etionamida.

 •   Microarray de DNA version completa (3.834 ORFs).
Detección mediante microarrays de cambios
        en los perfiles de expresión génica
•   La exposición a isoniazida aumenta significativamente la
    transcripción de dos clases de genes que codifican proteínas
    fisiológicamente relevantes para el modo de acción del fármaco:

•   A. Genes implicados en la síntesis de la pared celular, incluyendo
    un cluster de 5 genes (Rv2243-Rv2247) que codifica componentes
    del sistema FAS-II y fbpC (trehalosa dimicolil transferasa).

•   B. Genes implicados en procesos de respuesta a los efectos
    tóxicos del fármaco: efpA, fadE23, fadE24 y ahpC que codifica la
    alkil-hidroperóxido reductasa.

•   La etionamida genera un perfil similar de respuesta génica que la
    isoniazida en M. tuberculosis 1254.
Detección mediante microarrays de cambios
    en los perfiles de expresión génica

                     •   Microarray de DNA version reducida
                         (203 ORFs) de M. tuberculosis 1254.

                     •   Tratamiento isoniazida a 4 h.

                     •   Posiciones B13-16: cluster de genes
                         FAS-II (Rv2244-Rv2247).
                     •   Posiciones P2-P3: DNA control pre-
                         marcado con Cy3 y Cy5.
                     •   Posiciones A1, P1 y P16: DNA
                         genómico.
                     •   Posiciones A4-A10: DNA ribosómico.
Detección mediante microarrays de cambios
        en los perfiles de expresión génica

•   M. tuberculosis 4309A:
             • resistente a isoniazida
             • sensible a etionamida.

•   M. tuberculosis 4309A no presenta un perfil de expresión génica
    dependiente de isoniazida.

•   El tratamiento de M. tuberculosis 4309A con etionamida produce
    un perfil de expresión génica similar al de la cepa 1254 tratada con
    isoniazida: inhibición del sistema FAS-II.
Detección mediante microarrays de cambios
    en los perfiles de expresión génica

      Tratamiento isoniazida             Tratamiento etionamida

•   Microarray de DNA version reducida (203 ORFs) de M. tuberculosis 4309A.
Perfil de expresión génica temporal de M. tuberculosis 1254
                 en presencia de isoniazida

                                         („) - inhA
                                         (‹) - fas
                                         (o) - kasA
                                         (∆) - fadE24
                                         (+) - ahpC
                                         (⃞) - efpA
Confirmación de los perfiles de expresión génica de
     M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida

•   El análisis de microarrays muestra que la expresión de inhA y fas no
    cambia en presencia de isoniazida:
•   InhA, enoil ACP reductasa dependiente de NADH del sistema FAS-II
•   Fas, sistema FAS-I

•   Para comprobar los resultados obtenidos en los experimentos de
    microarrays, se realizaron experimentos de RT-PCR: comparación de
    la abundancia de transcritos kasA, efpA y ahpC en M. tuberculosis sin
    tratamiento y tratada con isoniazida.

•   La expresión inducida por isoniazida de estos genes se confirmó
    mediante RT-PCR.
Confirmación de los perfiles de expresión génica de
 M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida
Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida

•   La inducción de estos genes se detecta desde los 20 minutos después
    del tratamiento con isoniazida.

•   Por tanto, la inhibición del sistema FAS-II se detecta rápidamente y
    provoca una respuesta a nivel transcripcional.

•   Las células de M. tuberculosis tratadas con isoniazida reconocen los
    efectos del fármaco, y se activan mecanismos de respuesta mediante
    un aumento de la expresión de estos genes para tratar de compensar
    las actividades reducidas.

•   Como consecuencia del tratamiento con isoniazida, no se producen
    ácidos micólicos y ocurre una acumulación de precursores, ácidos
    grasos saturados (C24-C26), y una reducción de ácidos micólicos.
Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida

•   La acumulación de ácidos grasos saturados (C24-C26)
    probablemente refleja la etapa de la síntesis de ácido
    meromicólico que es interrumpida por la acción de la isoniazida.

•   La acumulación de precursores está asociada con un incremento
    de la producción de KasA y AcpM.

•   La inducción de estos genes es la consecuencia de un
    mecanismo de retroregulación que detecta el desequilibrio de
    precursores y la reducción de ácidos micólicos.

•   También es probable que la isoniazida induzca genes que
    codifican otros componentes relacionados de la ruta biosintética
    de ácido micólico.
Perspectivas
•   La investigación y desarrollo de fármacos antituberculosis es un
    reto continuado.

•   Los resultados de microarrays de DNA confirman las
    observaciones de estudios bioquímicos e indican nuevos genes
    directamente implicados en los procesos inhibidos por isoniazida.

•   Los resultados derivados de este tipo de estudios con microarrays
    de DNA pueden definir nuevas dianas para fármacos y sugieren
    nuevos métodos para identificar componentes que inhiben estas
    dianas.
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