DNA RECOMBINANTE E INGENIERÍA GENÉTICA

DNA RECOMBINANTE E
INGENIERÍA GENÉTICA

INGENIERÍA GENÉTICA

MANIPULACIÓN DEL DNA DE           LOS
ORGANISMOS VIVOS

1)  INVESTIGACIÓN BÁSICA (ESTUDIO DE LA
ORGANIZACIÓN, EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE
GENES EN LOS ORGANISMOS VIVOS).

2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN
LA MANIPULACIÓN CONSCIENTE DE LOS
GENES EN SALUD, EN LA INDUSTRIA DE
ALIMENTOS, EN LA AGRICULTURA, ETC.

PIEDRAS ANGULARES DE LA
       INGIENIERÍA GENÉTICA

1. CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS
   DE cDNA Y GENÓMICAS

2. DESCUBRIMEINTO DE LAS
   ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
   (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN)

3. DESCUBRIMIENTO DE LA REACCIÓN
   DE POLIMERIZACIÓN DE CADENA O
   PCR (POLYMERASE CHAIN REACCTION)

Técnicas de DNA Recombinante

EL OBJETIVO DE LA TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE es…………………

Aislar secuencias de DNA que contengan
genes y obtener múltiples copias de ellos

            para…………..

1. Conocer su estructura molecular

2. Estudiar su función biológica

3. Manipularlos

4. Transferirlos de un organismo a otro

⇒ Ingieniería Genética

TÉCNICAS

§        CLONAMIENTO MOLECULAR

§        PCR (reacción en cadena de la polimerasa)


      CLONAMIENTO DE UN GEN


   ETAPAS

1) Obtención del fragmento de DNA de interés (Gen).

2) Unión a un vector (DNA vehículo): Obtención de DNA
   recombinante.

3) Introducción en una célula hospedera (Objetivo: perpetuarlo y
      amplificarlo).

4) Rastreo (screening): Identificación de colonias que contienen
      el DNA recombinante de interés.

Clonamiento  de  un  Gen

DNA Vector

                       Fragmento de DNA

                         DNA recombinante

                         Amplificación del DNA en célula

                         hospedera

                           Identificación y aislamiento del

                           fragmento de DNA

Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes

        +1

CLONAMIENTO  MOLECULAR

            HERRAMIENTAS BÁSICAS

•    Enzimas de restricción

•    Vectores

•    DNA ligasa

•    Células hospederas

Enzimas de

Restricción

DIGESTION DEL DNA POR ENZIMAS
        DE RESTRICCION

Sitio  de  corte  enzimas  de  
         restricción  

CLONAMIENTO  MOLECULAR

            HERRAMIENTAS BÁSICAS

•    Enzimas de restricción

•    Vectores

•    DNA ligasa

•    Células hospederas

TIPOS DE VECTORES

Plásmidos, inserto 3-5 kpb

   Bacteriofagos, inserto 15 kpb

BACS, inserto 300 kpb

        YACS, inserto 2000 kpb

PLASMIDIO DE CLONAMIENTO

*Origen de replicación autónomo

*Marcador de selección

*Sitios únicos de restricción

CLONAMIENTO  MOLECULAR

            HERRAMIENTAS BÁSICAS

•    Enzimas de restricción

•    Vectores

•    DNA ligasa

•    Células hospederas

Ligación de fragmentos

de restricción con

extremos cohesivos

                  O

   p =

O-

   P

    O

                  O-

           CH2

                                 desoxiribosa

Clonamiento  Dirigido

Ligación

                              Ligación

de extremo

                             de extremo

cohesivo

                               romo

CLONAMIENTO  MOLECULAR

            HERRAMIENTAS BÁSICAS

•    Enzimas de restricción

•    Vectores

•    DNA ligasa

•    Células hospederas

PROPAGACION EN CELULA HUESPED

Genoteca de DNA

  Conjunto de clones recombinantes en los
   que está contenido el genoma o el DNA
  complementario (cDNA) de un organismo.

DNA genómico               Genoteca de
                           DNA genómico
      Transcripción

                           Genoteca de
RNA mensajero              cDNA

Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes

        +1

Genoteca de DNA Genómico
Generación mediante:

1.   Fragmentación de todo el genoma mediante
     enzimas de restricción

2.   Clonamiento de fragmentos en vectores

CLONES contienen diferentes fragmentos del genoma

                                           Enzimas de restricción

                                             DNA Ligasa

                                            Vector

                                           Célula huésped

Genoteca de cDNA

 Generación mediante:

§   Clonamiento de cDNA obtenido mediante
     transcripción reversa de mRNA total.

Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes

           +1

Purificar mRNA

total

Clonamiento por PCR

Reacción de Polimerasa en Cadena
             (PCR)
— Técnica utilizada en la detección y clonamiento de
  genes de interés.

— Diagnóstico Clínico.

— Medicina Forense.

Recordar siempre colocarle sitios

   de restricción a los partidores para

poder clonar el fragmento en un plasmidio

CLONAMIENTO DE UN
PRODUCTO DE PCR

fragmento de PCR

Estudio de la Función de un
            Gen

Vectores de Expresión

Vector de expresión en bacterias

-Amplificación del gen de interés por PCR.
-Clonamiento en vector de expresión.

-Regulación de la expresión del gen
 de interés en bacterias.

Vector de Expresión en Eucariontes

Transfección de células en cultivo:

*Uso de plasmidios

*Selección mediante el uso de derivados

de la gentamicina B1: G418

Expresión transitoria

                               Expresión estable

Resultado: Las células en cultivo expresan la
proteína

Transfección de celulas

Eucarióntes

-Uso de vesículas lipídicas

Electroporación

FUNCIÓN DE UN GEN

Herramientas de Estudio:

1. Análisis computacional en banco de datos:
   homología de secuencia con un gen de otro
   organismo cuya función se conoce.

2. Animales transgénicos.

Intervención en la biología animal:

Transgénesis y disrupción de genes

¿Qué es un animal transgénico?

Un animal transgénico es uno que porta un gen que ha sido
deliberadamente insertado en su genoma. El gen extraño es
construído e insertado utilizando metodología de DNA
recombinante.

Además el DNA del gen a ser incorporado debe incluir
otras secuencias que lo capaciten para:

-Ser incorpordo en el genoma del hospedante

-Ser expresado correctamente por las células
del hospedante.

¿Cómo generar un animal transgénico en el
Laboratorio?

Método 1: Inyección al pronúcleo masculino

La construcción linearizada es inyectada en el pronúcleo
masculino

Transgénicos del gen Sry (TDF en humanos)

RATONES TRANSGENICOS
El gen de la hormona de crecimiento se ha modificado geneticamente para que
                        se exprese en gran cantidad .

      El promotor de
metallothionein es regulado
        por metales                    Ratones alimentados con metales

Conclusiones:

-Integración muy temprana en el desarrollo.

-Antes de la división de la primera célula del cigoto.

-Antes de que la población de células germinales
segrega de las células somáticas primordiales.

-Integración estable en las celulas somáticas y
germinales.

-Transmición Mendeliana del gen transgénico.

Método 2:
Uso de células troncales embrionarias

Células troncales
        embrionarias
-Se pueden mantener en cultivo en los
laboratorios de todo el mundo

-Se pueden transfectar como cualquier
célula mantenida en cultivo

Células Troncales (Stem Cells)

1.

Células totipotentes (huevo fertilizado)

2.

Células pluripotentes


Células troncales embrionarias (ES cells)


Células germinales embrionarios (EG cells)


Células embrionarias carcinogénicas

3.

Células multipotentes

Obtención de Células Troncales Embrionarias

Para generarlas es necesario destruir el embrión

                                        Las células troncales

                                        embrionarias se pueden

                                        mantener indefinidamente

                                        indiferenciadas en el

                                        laboratorio

Generación de Animales Quiméricos

Las células troncales embrionarias

pueden ser insertadas en un embrión

en desarrollo

Las células troncales embrionarias se transfectan
con un gen X

                         Algunas células y tejidos

                         portarán el gen X

Implantación del trofoblasto en el oviducto del ratón

                                            X

             Madre Sustituta

Generación de ratones quiméricos

          Madre Sustituta

X

                X

Generación de ratón transgénico:

La quimera debe poseer el gen X en sus células germinales

           X

     quimera

                      ratón silvestre

            X

      transgénico

Método de transferencia nuclear

Dolly

Animales transgénicos producidos por transferencia

                     nuclear

Gene X

Gene X

            x

Transgénicos de lactoferrina en bovino

Utilizar la leche del ganado bovino como “reactor”para generar grandes
cantidades de una proteína humana de interés biológico

Interés global de la industria alimenticia

Transgénicos de lactoferrina humana

   Promotor de caseina

FIN