Reparación del Daño al DNA
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Reparación del Daño al DNA
Mecanismos específicos y generales de
reparación
Mecanismos de
Mutaciones Reparación
Diversidad Fidelidad
Inestabilidad p
Supervivencia
Errores en la replicación Daños endógenos o exógenos
Reparación mutagénica
Mutagénesis
reparación
* No genere cambio muerte
* Mejore
* Empeore
1Evidencia de Mecanismos de Reparación
Mutagenésis
Lesión
Sobrevivientes
Analizar la curva de sobrevivientes
En función de la dosis o del tiempo
Medio sin selección Medio con selección
mutágeno
No estoy mirando
Mutantes!!!!
Tiempo o dosis
Como reconocen el daño estos mecanismos?
Algunos reconocen daños específicos, otros alteraciones
en la estructura del DNA
Ejemplos de Mecanismos específicos
Glicosilasas
Metiltransferasas
Fotoliasa
Ejemplos de Mecanismos generales
Sistema de reparación metil dirigido
NER
2Como reparan el daño al ADN?
Revierten el daño
* Fotoliasa
* Metiltransferasas
Remueven el daño
* B.E.R.
* N.E.R.
* Sistema de reparación metil dirigido
Además de estos productos génicos específicos, se
requieren de otros productos que participan de estas vías
como ser: ligasa, exonucleasas, polimerasas.....
Respuestas celular al daño del DNA
1) Mecanismos específicos de reparación
• Sistema de reparación de segementos muy cortos
(VERY SHORT PATCH REPAIR OF 5´MC)
• Fotoreactivación.
• Reparación al daño por Oxigeno reactivo
• Reparación de la alquilación del ADN.
2) Mecanismos generales de reparación.
• Reparación por excision de bases
(BER, BASE EXCISION REPAIR).
p
• Reparación p
por excision de nucleotidos
(NER, NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR.
• Sistema de reparación metil dirigido
(MISMATCH REPAIR).
3) Tolerancia al daño.
3DNA glicosilasas y AP endonucleases
Desaminación
Hidroxilamina, Bisulfito, Ac Nitroso
Adenina HX C
Guanina X T
Citosina Uracilo A
5-MC Timina A
Hot spot
Los sitios AP son una seria dificultad para el aparato
replicativo
Very Short Patch Repair
La mayoría de las 5-MC occurren en la segunda C de la secuencia
5’ CCWGG 3’
Metilación ocurre por la enzima Dcm 5’ CmCAGG 3’
VSP la Vsr endonuclease remueve una T del par T:G en la
secuencia 5’ CmCAGG3’/CTWGG
La cadena es resintetizada por DNA Pol I
Sitio caliente de mutación para un determinado gen
4Fotoreactivación
Fotoreactivación es un proceso dependiente de la luz e involucra
monomerización de dimeros de pirimidina.
El proceso es llevado a cabo por la DNA Photolyase codificada por
phr.
La fotodimerización es favorecida a longitud de onda 280 nm,
monomerización a 235 nm.
Como lo descubrieron?
Revierte el daño
Fotoreactivación
Phr endonuclease
FAD dependiente
5Reparación del daño al Oxigeno
Cuales son las especies
Tóxicas del O2?
Como se producen?
N-glycosylase/AP-endonuclease
(Inducible by O2 stress)
N-glycosylase
Phosphatase
Genes mut son aquellos involucrados en reducir la tasa de
mutaciones espontaneas
Que pasa si sobreexpreso los genes mut y que pasaría si los muto
Alquilación del ADN
Agentes alquilantes
EMS N7 of G
MMS N3 of A
NTG
Los fosfatos de la cadena también son alquilados
6Rutas para reparar DNA Alquilado
N-glycosylase: Remueve la base alquilada y luego una AP endo
(AlkA) corta la cadena en los sitios apurinicos o apirimidinicos
apirimidinicos, Pol I
termina de rellenar la cadena
Methyltransferases: in E. coli las MT más relevantes son Ogt (expo
phase) and Ada (stationary phase)
Reparación del daño por alquilación
Se encontró pérdida selectiva de O6-methyl guanine 38
en el DNA a travez del tiempo.
Se encontró que una enzima llamada
methyltransferase I=Ada se unia a O6-methyl
guanine-DNA.
38
Se encontró que Ada tiene amplia especificidad de
sustratro: alkyl transferase.
Ada is una “enzima suicida”. Su actividad es
38
consumida en la reacción que cataliza. Toma grupos
metilos de O6-methyl guanine y los transfiere a sus
propias Cysteinas, inactivandose ella misma el el
proceso.
7Regulation de la Adaptacion al Daño por Alquilación
Region requerida para la unión de Ada como FT en la region
promotora de los genes participante de la respuesta adaptativa.
Ada tiene 2 funciones:
1) Repara DNA.
2) Es un activador
transcripcional
alkA esta reprimido en fase
estacionaria (sigma S)
Respuesta celular al DNA Dañado
1) Mecanismos Específicos de Reparación:
•PHOTOREACTIVATION.
•ADAPTATION TO DAMAGE.
•REPAIR OF ALKYLATED DNA.
2) Mecanismos Generales de Reparación (EXCISION REPAIR).
•BASE EXCISION REPAIR.
•NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR.
•MISMATCH REPAIR.
3) Tolerancia al DNA Dañado.
•REPLICATIVE BYPASS WITH GAP FORMATION AND
RECOMBINATION.
8Desaminacion de Bases
Agentes Desaminantes
•Hydroxylamina:
H d l i remueve grupos amino
i d de C causa GC to AT
actua in vitro
•Bisulfito: Deamina solamente C en ss DNA GC to AT
•Nitrous Acid: remueve grupos amino de C, A y G, puede ser
usado in vivo e in vitro
•Desaminación espontanea: por ejemplo a altas temp
C to U
5-MC to T
Hidroxylamine
G:C to A:T
9HNO2 :: A
HNO2
:: C
HNO2 :: T
10DNA Glicosilasas
Todas las DNA Glicosilases producen la liberación catalítica de
bases que forman el DNA.
-Algunas son especificas, y otras más generales. Tienden a
reconocer lesiones “non-bulky” o no muy distorsivas.
- Algunas son parte del regulon Ada.
Existen dos clases, dependiendo si son también capaces de
hidrolizar uniones fosfodiester:
-Si solo rompen uniones glicosidicas.
-Ellas necesitan ademas una 5’ AP Endonuclease.
-Estan aquellas que se encuentran asociadas a una
actividad endonucleasa.
-Seria una 3’ AP lyase Endonuclease.
Eventos Post-Incision
11DNA deoxyribophosphodiesterase (dRPase)
Lleva a cabo un corte hidrolitico de residuo 2’-
deoxyribose-5’-phosphate a partir del extremo 5’ de
interrupciones single-strand en el DNA conteniendo
sitios con peridas de base.
- Por ejemplo
j p g gen recJ de E. coli.
Removal of the 5’-deoxyribose phosphate
12Repair Synthesis of DNA
E. coli DNA Polimerasa
1) Pol I (polA) requiere duplex DNA.
2) Pol II (dinA). Gen SOS .
p
-El sustrato óptimo es duplex
p DNA con gaps
g p cortos.
-Lleva a cabo reparacion asociada a sintesis de excision
gaps generados duranteBER o NER.
-Solo tiene actividad 3’-5’ Exonuclease.
3) Pol III.
-Lleva a cabo sintesis del DNA durante replicación.
E. coli DNA LIGASE.
-Requiere Mg++ y NAD.
13Repara solamente distorciones grandes en el DNA
Nucleotide Excision Repair (NER)
1) Cinco genes identificados como necesarios para realizar “dark repair”
de dímeros de dímeros de pirimidina.
-uvrA.
-uvrB.
-uvrC
-uvrC.
-uvrD.
-polA. DNA pol I.
2) Mutantes son sensibles a UV y a químicos.
3) UvrA, UvrB and UvrC son requeridos para incision endonucleolytica
de DNA conteniendo dímeros de pirimidina.
4) La UvrABC es una endonucleasa especifica de daños en E. coli.
-Requiere ATP.
-Reconoce distorciones “bulky” en el DNA.
14Modelo para NER
Sistema de reparación metil dirigido:
Reconoce distorsiones menores del ADN
Analogs de Base
15Methyl-Directed Mismatch Repair
1) Reconoce el estado de metilacion en la posicion
N6 de la Adenina en la secuencia GATC como
mayor mecanismo para determinar que cadena sera
reparada.
2) Varias mutantes fueron aisladas las cuales fueron
incapaces de llevar adelante methyl-directed
mismatch repair, y por lo tanto tenían una alta tasa
de mutacion
mutacion.
Mutaciones encontradas en:
-mutH.
-mutL.
-mutS.
-uvrD. Helicase II.
Methyl-Directed Mismatch Repair
Repara solamente distorciones menores de la
helice incluyendo:
Mismatches
Frameshifts
Incorporación de análogos de base
Algunos daños producidos por agentes alquilantes
Como determinar el rol de la metilación en el sistema de
R
Reparación
ió metilil di
dirigido
i id
Fago , a- obtenido de E.coli dam+
Fago, b- obtenido de E.coli dam- heteroduplex Fago mut a-
Fago , a- obtenido de E.coli dam- heteroduplex Fago mut b-
Fago, b- obtenido de E.coli dam+
16-MutS.
•Binds to DNA substrates with a mismatch (to the
mismatch itself).
•ATPase.
•It loops the DNA into an a-shaped structure in the
presence of ATP.
•At the ends of the loop there is an interaction of the
mismatch with the nearest GATC site.
-MutL.
•It binds to MutS/DNA heteroduplex complexes.
-MutH.
•Mg++-dependent Endonuclease.
•It cleaves un-methylated DNA strands in un-methylated or
hemi-methylated DNA 5’ to the G in GATC.
Un-methylated DNA: One cut, randomly.
Hemi methylated DNA:Cut in un
Hemi-methylated un-meth.
meth strand.
strand
Fully-methylated DNA: No cuts.
Methyl-Directed Mismatch Repair
17Respuesta celular al DNA Dañado
1) Mecanismos Específicos de Reparación:
•PHOTOREACTIVATION.
•ADAPTATION TO DAMAGE.
•REPAIR OF ALKYLATED DNA.
2) Mecanismos Generales de Reparación (EXCISION REPAIR).
•BASE EXCISION REPAIR.
•NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR.
•MISMATCH REPAIR.
3) Tolerancia al DNA Dañado.
•REPLICATIVE BYPASS WITH GAP FORMATION AND
RECOMBINATION.
Aislamiento de genes mutadores: Análisis de papilación
Tratamiento con mutágenos
CFU
papilas
Observar en una colonia la aparición de revertantes
lacZ- lacZ +
Placa tiene X-gal
18También puede leer
