PROCESAMIENTO DE LAS LESIONES DEL ADN: REPARACION Y MUTAGENESIS. RESPUESTA ADAPTATIVA
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PROCESAMIENTO DE LAS
LESIONES DEL ADN:
REPARACION Y MUTAGENESIS.
RESPUESTA ADAPTATIVA
Javier Santos, Profesor Titular de Genética
Departmento de Biología Celular e Inmunología. Centro de Biología
Molecular “Severo Ochoa”. Universidad Autónoma de Madrid
La radiación ionizante es un potente agente genotóxico y
mutagénico
Los efectos de la radiación ionizante dependen del tipo y
dosis recibida
Radiación ionizante Respuesta
de baja transferencia Adaptiva
1-500
de energía mGy
100 Eliminación de la mayor ía de las células aberrantes
mGy
pero no todas
Células preneoplásicas
Mutac iónes
Microambiente, tisular
y
y Clon neoplás ico
cambios
sistema inmune
epigenéticos
Cáncer invas ivo
Acción directa de las radiaciones ionizantes sobre el ADN:
Roturas de cadena sencilla (SSBs) y doble cadena (DSBs)
Mutaciones cromosómicas
Acción indirecta de las radiaciones ionizantes sobre el
ADN: Especies Reactivas de Oxígeno
Radiolisis del agua
Bases con daño oxidativo
Especies reactivas de oxígeno (ROS)
SSBs/DSBs
Mutaciones génica
Mutaciones cromosómicas
Los sistemas biológicos de protección frente a la RI:
un regalo evolutivo
Los primeros mamíferos tuvieron que vivir en un
ambiente con unos niveles de RI natural mucho más
elevados que los actuales
Se adaptaron a este ambiente hostil desarrollando
un sistema de protección natural genes de
respuesta a la RI
Genes de respuesta a la RI:
1.Producción de antioxidantes
2.Sistemas de reparación del ADN
3.Apoptosis de células severamente dañadas
4.Proceso apoptótico protector mediado
epigenéticamente (o epiapoptosis) que elimina
selectivamente las células precancerígenas
5.Estimulación del sistema inmune frente al cáncer
¿Cómo se protege
contra los efectos Fenotipo de protección adaptativa
de las RI? activado por bajas dosis de RI (
PARTE I MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL DAÑO RADIOINDUCIDO Sistemas preventivos frente al daño oxidativo
Reparación de bases con daño oxidativo y SSBs
Sistemas de reparación “GO”
Reparación de bases con daño oxidativo y SSBs
Sistema de reparación por escisión de bases (o BER, Base Excision Repair)
- Has an apurinic and/or apyrimidinic
endonuclease activity and a DNA N-
- Excises 8-oxoguani ne fr om dama ged glycosylase activity.
DNA
-Incises damaged DNA at cytosines,
- Has a beta-lyase activity that nicks DNA thymines and guanines.
3' to the lesion
- Ac ts on a damaged strand, 5' from the
damaged site.
Reparación de bases con daño oxidativo y SSBs
PARP1 (Poly (ADP- Ribose) Polym erase 1)
recluta al com plejo XRCC1-LIG3
XRCC1-LIG3
XRCC1-LIG3
XRCC1
Reparación de bases con daño oxidativo y SSBs
APE1 y PNKP son necesarios para el procesam iento de los extrem os de los SSBs inducidos por la RI
XRCC1-LIG3
Reparación de DSBs
dosis, la tasa de dosis, la naturaleza de la radiación y del momento del
ciclo celular en el que se encuentre la célula. A dosis bajas de rayos X,
los sistemas HR reparan eficientemente los DSBs, mientras la
fidelidad de la reparación es menor en el caso de los sistemas dosis, la
tasa de dosis, la naturaleza de la radiación y del momento del ciclo
celular en el que se encuentre la célula. A dosis bajas de rayos X, los
sistemas
Une de HR reparan eficientemente los DSBs,
m anera
una
mientras
Utiliz a secuenciaslahom
crom átida
fidelidad
ólogas de
herm ana,
de la
directa los extrem os
no hom ólogos del
reparación es menor en el caso de
crom los sistemas
osom a hom ólogo, o una
secuencia repetitiva com o m oldes
ADN d añado
para la reparación del ADN dañado
Factores que determ inan la elección de HRR o NHEJ:
- Etap a del ciclo celular
-Señalización del factor de crecim iento
-La naturaleza de los extrem os de los DSBs
-La dosis recibida y la naturaleza de la radiación
Reparación de DSBs
XRCC1-LIG3
Reparación de DSBs
MMEJ
Microhomology-mediate d end j oing
HR
NHEJ
XRCC1-LIG3
Reparación de DSBs
XRCC1-LIG3
Reparación de DSBs
XRCC1-LIG3
C
Respuesta celular a los DSBs inducidos por las RI
XRCC1-LIG3
Respuesta celular a los DSBs inducidos por las RI
ATM interviene en la
vía de reparación
NHEJ cuando los
DSBs ocurren en la
fase G1 ATM es necesario tanto para la
activación de la vía AT R-Chk1
com o para iniciar la reparación del
ADN m ediante recom binación
hom óloga (HRR), prom oviendo la
form ación de ADN de cadena
sencilla en los sitios de daño a
través de la resección nucleolítica
XRCC1-LIG3
Respuesta celular a los DSBs inducidos por las RI
ATM es necesario tanto para la activación de la vía AT R-Chk1 com o para iniciar la reparación del ADN
m ediante recom binación hom óloga (HRR), prom oviendo la form ación de ADN de cadena sencilla en los
sitios de daño a través de la resección nucleolítica
XRCC1-LIG3Respuesta celular a los DSBs inducidos por las RI
Control del ciclo celular m ediado por ATM/ATR en respuesta al daño radioinducido
XRCC1-LIG3
Respuesta celular a los DSBs inducidos por las RI
XRCC1-LIG3Papel de p53 en el control del daño en el ADN radioinducido
XRCC1-LIG3
Niveles d e
fosforilación
variables
Papel de p53 en el control del daño en el ADN radioinducido
Ejemplos de funciones de p53 independientes de transactivación HR
XRCC1-LIG3Papel de p53 en el control del daño en el ADN radioinducido
Funciones de p53 dependientes detransactivación
XRCC1-LIG3
La interacción de Gadd45a o Gadd 45b con PCNA juega un papel im portante en NER
PARTE II
MECANISMOS DE ELIMINACION
DE CELULAS CON DAÑO
RADIOINDUCIDOTipos de muerte celular
MUERT E CEL ULAR
Muerte celular regulada Muerte celular NO regulada
genéticamente genéticamente
Necrosis
Muerte celular Muerte celular nuc lear Muerte celular mitótica
por (Paraptosis) (Catástrofe mitótica)
autofagia
Apoptosis Necroptosis o Necrosis-like
Extrínseca Intrínseca
Receptores Receptores Dependiente de caspasas Independiente de caspasas
de de (Apoptosis –like)
m uerte dependencia
¿Qué es la apoptosis?
- Form a fisiológica de m uerte celular Acuñado por Kerr,
- Se desencadena por m últiples estím ulos Wyllie & Currie (Kerr
et al, Br J Cancer,
- Esencial en los procesos de desarrollo 1972)
- Su alteración puede prom over cáncer, autoinm unidad y desórdenes degenerativos
Apoptosis no es sinónimo de muer te celular programada ni de activ ación por caspasas
Cam bios m orfológicos asociados al fenotipo apoptótico: 1
1. Redondeo de la célula
XRCC1-LIG3 2
2. Reducción del volum en nuclear (condensación de la crom atina
3
3. Reducción del volum en celular (condensación del citoplasm a)
4. Rotura de la m em brana nuclear
5. Fragm entación nuclear 4
5
6. Granulación de la m em brana plasm ática 6
7
7.Fragm entación celular (cuerpos apoptóticos)
8.Requiere energía y afecta a células individualesRutas apoptóticas
Receptores de Mitocondria -
muerte (DR) - Intrínseca
Extrínseca
XRCC1-LIG3
Rutas apoptóticas
Caspasa ejecutora (E) inactiva (zimógeno)
H2N COOH
Corte por otra caspasa iniciadora (I)
Fragmentos resultantes
Subuni dad grande Subuni dad pequeña
Agregación de las subuni dades
de las caspasas ej ecutotas
Caspasa ejecutora (E) XRCC1-LIG3
activa
Proteolisis de las
proteínas diana
Inactiv ación de la Activ ación de la proteína
proteína secuestradora que corta la actina Otras dianas
de la endonucleasa de DNA
Fragmentación Pérdida de la morfología Descomposición Fragmentación
del DNA celular normal de orgánul os de la célulaApoptosis extrínseca
Apoptosis Apoptosis
extrínseca extrínseca
por por
receptores receptores
de de
muerte dependencia
XRCC1-LIG3
Apoptosis extrínseca
XRCC1-LIG3Apoptosis extrínseca
Receptores de dependencia
Se caracterizan por su capacidad para activar la señalización de dos vías opuestas.
En presencia de ligando, estos
receptores activan las vías
clásicas de señalización
im plicadas en la supervivencia
celular, la m igración y la
diferenciación.
XRCC1-LIG3
En ausencia de ligando no se
quedan inactivos, sino que
provocan una señal apoptótica
Apoptosis extrínseca
Apoptosis
extrínseca por
receptores
de
dependencia
DCC
Y
UNC5
XRCC1-LIG3Apoptosis intrínseca
Apoptosis Apoptosis-like
clásica (no caspasas)
Ti pos de
condensación
XRCC1-LIG3 de la cromatina
Autofagia asociada a la muerte celular
Características de la muerte por autofagia:
1.No condensación de la cromatina
2.Masiv a v acuolización del citoplasma
3.Acumulación de v acuolas autofágicas
Autofagia : 4. Requiere genes de autofagia
Proceso en el que las células generan energía y
metabolitos por digestión de sus pr opios
orgánul os y macromoléculas.
XRCC1-LIG3 XRCC1-LIG3
La autofagia permite Las células que no
que la célula se priv e reciben los nutrientes
de factores de durante largos períodos
crecimiento para en última instancia,
sobrev ivir. digieren todos los
sustratos disponibles y
mueren (autofagia
asociada a la muerte
celular).Necrosis
Características de la muerte por necrosis:
1.Aumento del v olumen citoplásmico
2.Aumento del v olumen de los orgánulos celulares
3.Moderada condensación de la cromatina
4.Lisis nuclear sin fragmentación específica de la cromatina
1-3 5.Aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática
6.Rotura de la membrana plasmática
7.Respuesta inflamatoria
4-5 XRCC1-LIG3
8.No requiere energía y afecta a grupos de células contiguas
Norm al Necrosis
6-7
Necroptosis o forma regulada de muerte por necrosis
XRCC1-LIG3Necroptosis o forma regulada de muerte por necrosis
XRCC1-LIG3
Muerte celular nuclear o paraptosis
L a muerte celular nuclear está regulada por PARP1 y se asemeja morfológicamente a la necrosis
XRCC1-LIG3Muerte celular mitótica o catástrofe miitótica
La catástrofe m itótica se refiere a los casos de m uerte celular que se activan cuando ocurre una
m itosis aberrante y que se ejecutan bien durante la propia m itosis o en la interfase posterior
XRCC1-LIG3
Características de la m uerte celular m itótica
1. Im plica m icro y m ultinucleación
2. Ocurre com o consecuencia de alteraciones en los puntos de control del ciclo celular
y del daño en el ADN
3. No es en sí m ism a un mecanism o de m uerte celular, sino una via on cosupresora
distinta de las rutas de m uerte celular o senescencia
Muerte celular mitótica o catástrofe miitótica
XRCC1-LIG3
SURVIVINA:
- Expresada en las fases G2 y M del ciclo celular
- Asociada con los m icrottúbulos del huso m itótico
- Regula la segregación de los crom osom as
- Necesaria para el m antenim iento del punto de control del huso
INACTIVACION de la SURVIVINA SOBREEXPRESION de la SURV IVINA
da lugar a la aparición de m itosis confiere resistencia a la m uerte. Esta
aberrante elevada en células tum oralesPARTE III
BAJAS DOSIS DE RI Y
RESPUESTA ADAPTATIVA
¿Qué se entiende por respuesta adaptativa?
Respuesta adaptativa (RA): es un mecanismo biológico de defensa por el que la exposición de una
célula a una situación de estrés, como puede ser la radiación, estimula sus sistemas de defensa
natural, protegiéndola contra posteriores situaciones de estrés.
Experimentalmente, la RA se ha estudiado mediante la exposición de las células a una dosis baja de
radiación para inducir la respuesta adaptativa (dosis condicionante), seguida de una dosis de
prueba alta (dosis provocadora) y la comparación de dicha respuesta con la de una exposición a
una dosis alta de radiación: Respuesta Radioadaptativa (RRA)
La RRA se ha demostrado en células de mamífero in vitro e in vivo después de exposiciones agudas
y prolongadas a radiación X o gamma
Otros criterios de valoración:
Radio-Adaptive Response (RAR)
-Aparición de aberraciones
Prim e dose Challenge dose crom osóm icas
0,075 Gy 1,75 Gy -Inducción de m utaciones
6 hours after the
priming dose
-rays -rays -Form ación de m icronúcleos
-Tasa de reparación
-Incidencia de tum ores
Significant reduction in thym ocyte apoptotic indu ction w hen
RAR w as com pared w ith an acute radiation exposure of 1.75 Gy
-Periodo de latencia tum oral
-Supervivencia del individuoRespuesta radioadaptativa
Dos parámetros fundamentales definen el fenómeno radioadaptativo:
(i) La dosis condicionante que es requerida para inducir de manera efectiva una vía de señalización
radioprotectora
(ii) El intervalo de tiempo que tiene que transcurrir entre la exposición a la dosis condicionante y
dosis provocadora
La RRA se produce a dosis condicionantes
de radiación que oscilan entre 0,01 y 0,5 Gy o Efecto Yonezawa
bien a tasas de dosis que van desde 0,01
hasta 1,0 Gy min-1
Dosis Dosis
condicion ante provocadora
La RRA resulta más beneficiosa a dosis
200 mGy y rara vez se ve a una dosis >500 2 m eses
mGy Si RRA
0,3-0,5 Gy 8 Gy
2 sem anas
0,2 Gy 8 Gy No RRA
La RRA es un fenómeno con un alto grado de 2 a 5 m eses
variación intra e interindividual:
0,025 Gy 8 Gy No RRA
(i) Tasa de dosis > 2 m eses
(i)Tiempo transcurrido entre dosis
(ii)Variación genética entre individuos
Modelos animales de respuesta radioadaptativaRespuesta radioadaptativa ambiental y ocupacional
Mecanismos implicados en la respuesta radioadaptativa
Prev ención de
daño ROS:
aumento
antioxidantes
Reparación del
daño:
activación
si stemas de
XRCC1-LIG3
reparación
Eliminación del
daño :
muerte celular
programada
y
respue sta inmuneLa respuesta adaptativa provoca una estimulación inmunológica
Papel de las DCs en la repuesta antitumoral
Consecuencias funcionales de una diferenciación incorrecta de las DCs en cáncer
Respuesta radioadaptativa
XRCC1-LIG3 Aumento de la
capacidad
de activación de
linfocitos T y B
Aumento de la producción de
IL-2, IL-12 e INF- por las DCs
Tom ado de Gabrilovich (2004), 4: 941-952
Patrón temporal de activación de los sistemas de protección
asociados a la respuesta radioadaptativa
Antiox idantes,
Muerte celular
programada Repar ación del A DN Sistema inmune
Respuesta nor malizada
0
0 Horas Días Semanas Meses
Tiempo después de una únic a dos is (escala logar ítmic a)Factores genéticos implicados en la respuesta radioadaptativa
Dos perfiles transcripcionales contrapuestos asociados a la respuesta radioadaptativa
en líneas celulares humanas de origen linfoblastoide
Expresión reducida Expresión aumentada
Genes implicados en: Genes implicados en:
-Proliferación celular -Control negativo del ciclo celular
-Señales de transducción mitogénicas -Señales de transducción antimitogénicas
-Apoptosis -Respuesta a situaciones de estrés celular
-Sistemas de reparación de DSBs -Sistemas de reparación BER (Parp1, APE1)
En las células radioadaptadas ocurren mayoritariamente
SSBs o modificaciones de bases más que DSBs
??
Vía de señalización ATM-TRP53
Baja dosis de Alta dosis de
radiación radiación
MDM2 ↑ Fosforilación de A TM ↓
tiempo
TRP53 ↑ TRP53 ↑↑ Fosfo-TRP53 ↓
Repar ación p21 ↑
Apoptos is Apoptos is
Parada del ciclo celular
Contribución del efecto “Bystander” a la respuesta radioadaptativa
Posible mecanismo
El efecto implicado
“bystander” en la relación
sobre células efectono
no irradiadas “bystander”-respuesta radioadaptativa
tiene porque ser siempre perjudicial
Iniciadores
Mediadores
Cell
type
Modificado d e M atsumoto et al. (2004)
BiolModific ado de
Sci Space, Matsumoto et al . (2009)
18:247-254
J Radiat R es, 50:A67- A79Etapas fundamentales de la respuesta radioadaptativa
La respuesta radioadaptativa se puede dividir en tres procesos biológicos sucesivos:
(i) la respuesta
adaptativa
intracelular
(ii) las señales
extracelulares
promovidas por las
XRCC1-LIG3
células irradiadas que
inducen la adaptación
de las células
“bystander”
(iii) el mantenimiento
del status
radioadaptativo
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