DNA STRIP Tecnología Genotype
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Tecnología Genotype
DNA•STRIP®
Infecciones causadas por
micobacterias
• Género Mycobacterium: BAAR, aerobios
• Pared celular compleja: exigente desde el punto de vista
nutricional, la mayoría crecen lentamente
• Algunas especies son patógenos (intracelulares obligados) de
humanos, y otras especies oportunistas.
Enfermedades causadas por Micobacterias:
• Tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis
• Lepra: Mycobacterium leprae
• Micobacteriosis: infecciones debido a otras micobacterias
Infecciones causadas por
micobacterias
Diagnóstico de laboratorio:
• Coloraciones que denotan ácido resistencia
• Cultivo
• Técnicas de biología molecular
• Las infecciones por Micobacterias son difíciles de tratar. Son
naturalmente R a varios atb y pueden desarrollar resistencia
a otros atb.
• La mayoría son susceptibles a claritromicina y rifampicina,
pero se conocen cepas resistentes a estos antibióticos.
Revisión de la tecnología
DNA••STRIP®
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
Evaluación
Tecnología DNA•Strip®
Aislamiento del ácido
nucleico
AMPLIFICACION selectiva
de varios fragmentos del
AN aislado utilizando
primers específicos
marcados com biotina
PCR multiplex
Tecnología DNA•Strip®
Hibridizacion:
El DNA amplificado se
coloca en la matriz de
DNA•STRIP® donde se
encuentran sondas de ADN
específicas
La reacción de hibridización
lleva al desarrollo de
bandas visibles en la matriz
del DNA•STRIP®
Revisión de la tecnología
DNA••STRIP®
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
Evaluación
Aislamiento del DNA
Aislamiento del DNA
Extracción del ADN: GenoLyse
500µl de muestra 100µl de lisis 100µl de buffer 5µl de sobrenadante
buffer 5 min 95°C
decontaminada de neutralización a PCR
15 min 10.000 g 5 min Máxima velocidad
Descartar sobrenadanteRevisión de la tecnología
DNA••STRIP®
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
EvaluaciónAmplificación por PCR para Mycobacterium CM/AS/MTBC
Amplificación por PCR para MTBSRplus v2.0
Revisión de la tecnología
DNA••STRIP®
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
EvaluaciónHibridización Reversa
Desnaturalización Pegado de los
Separación de de los productos de PCR amplicones marcados
amplicones en con biotina a las
DNA simple sondas del strip
cadena Hibridización
Remoción del AN
Union del conjugado
pegado
streptavidina -
Lavado astringente inespecíficamente
fosfatasa alcalina a
a las sondas
la biotina de los
hibridos
Conjugado Tinción enzimática
con el sustrato de la
fosfatasa alcalina
SustratoDesnaturalización
Separación de los amplicones en DNAsc
PCR product (labelled, double-stranded DNA)
chemical denaturation
labelled, single-
stranded DNAHibridización
Pegado de los productos de PCR
S
o
n
d
Sno
e
ed
e
b
M
m a
e
rn
itfs
armMbe
4
5
°C
iftenrs
45C°
45°C
probeLavado Astringente
de productos de PCR pegados inespecíficamente
no mismatch
45°CLavado Astringente
de productos de PCR pegados inespecíficamente
asm
i tch!Conjugado
Pegado de los complejos conjugados
conjugateReacción del Sustrato
Coloración enzimática
substrate substrate
brown colorless
DNA•STRIP®Revisión de la tecnología
DNA••STRIP®
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
EvaluaciónEvaluación
Linea Positiva: la intensidad es mayor o igual
que la del control universal (UC).Tecnología DNA•Strip®
Interpretación de Resultados
La interpretación
es realizada
comparando el
perfil de bandas
desarrollado en el
DNA•Strip® con
un templado para
evaluaciónTecnología DNA•Strip® Interpretación de Resultados
Tecnología DNA•Strip®
Interpretación de Resultados
Comparación del perfil de
bandas de DNA strip con el
cuadro de interpretaciónUtilización del polimorfismo
de los genes
• Todos los ensayos DNA•STRIP® se denominan
“GenoType”.
• “GenoType” porque usa el polimorfismo de la
estructura genética de la Mycobacteria.
• El uso de PCR es para lograr máxima sensibilidad.Tecnología DNA•Strip®
Aplicaciones
DNA•Strip® technology es principalmente usada para:
• Enfermedades asociadas al polimorfismo genético
• Diferenciación de especies microbianas
• Determinación de Resistencia antibiótica
• Diagnóstico dental: determinación de marcadores
periodontopatogénicos y riesgo genético de desarrollo
de periodontitis.Material Requerido
– Cabina de seguridad Clase II
- Baño termostático
- Baño sonicador (opcional)
- Microcentrífuga
– Plataforma de agitación/TwinCubator®
– Termociclador
- Material descartable
– DNA polymerasa termoestable (hot start)encon
Incluída buffer
MTBDRplus v2.0DNA•Strip® technology
Fortalezas
Flexibilidad: Permite varias amplificaciones en la misma
corrida
No requiere purificación de AN (excepto en MYCO Direct)
No requiere TB viable (excepto en MYCO Direct)
Puede realizarse aún cuando el cultivo/muestra este
contaminada
Resultados rápidos (6 hs)
Permite detección de infecciones mixtasGenoType® Series Micobacterias GenoType® Mycobacterium CM/AS GenoType® MTBC GenoType® MTBDRplus GenoType® MTBDRsl GenoType® Mycobacteria Direct (RNA)
GenoType Mycobacterium CM/AS
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
EvaluaciónGenoType Mycobacterium CM/AS • CM: identificación de14 especies de Mycobacterias atípicas más comunes, y complejo Mycobacterium tuberculosis • AS: identificación de 16 especies de Mycobacterias atípicas adicionales • A partir de bacterias en medio sólido o líquido. • No aplicable para muestras clínicas • Controles: Control de conjugado (CC) Control Universal (UC) Control de género (GC)
GenoType Mycobacterium CM
Diferenciación entre 14 especies de Mycobacterias atípicas
más comunes y M. Tuberculosis complexGenoType Mycobacterium AS Diferenciación entre 16 especies adicionales de Mycobacterias atípicas
GenoType MTBC
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
EvaluaciónGenoType MTBC • Diferenciación dentro del complejo M. tuberculosis • A partir de bacterias en medio sólido o líquido. • No aplicable para muestras clínicas • Controles: Control de conjugado (CC) Control Universal (UC) Sonda específica de MTBC
GenoType MTBC Diferenciación dentro del complejo M. tuberculosis
GenoType MTBDRplus v2.0
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
EvaluaciónBases Moleculares de R en MTBC
Drug Gene Locus Gene function Percentage
of
Resistance
Isoniazid katG Catalase-Peroxidase 40 - 100 %
inhA Enoyl-ACP-Reduktase appr. 25 %
ahpC-Promoter Alkyl-Hydroxid-Peroxidase appr. 10 %
Rifampicin rpoB ß-Subunit of RNA- > 90 %
Polymerase
Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase appr. 95 %
Streptomycin rpsL ribosomal Protein S12 appr. 60 %
rrs 16S rRNA appr. 20 %
Ethambutol embB Arabinosyl-Transferase appr. 60 %
Chinolone gyrA DNA-Gyrase A appr.80-90%
Aminoglycoside rrs 16S rRNA No exact
Cyclic Peptide data
MTBDR plus
MTBDR slRegión de R a Rifampicina del gen rpoB
en MTBC
r poB WT2 r poB WT4 r poB WT6
r poB WT1 r poB WT3 r poB WT5 r poB WT7 r poB WT8
505 508 509 511 513 514 515 516 518 522 526 531 533
r poB MUT1 (D516V) r poB MUT2B (H526D)
r poB MUT3 (S531L)
rpoB-Wildtype-probes: WT 1 to WT 8
rpoB-Mutation-probes: MUT D516V, H526Y, H526D, S531L
Detección de mutaciones por ausencia de señales wildtype
Detección de mutaciones por presencia de señales de mutaciónZonas de Reacción del GenoType®
MTBDRplus v2.0
Control de conjugado (CC)
Conjugate Control (CC) Debe desarrollar una línea en esta zona, documentando la eficiencia del pegado
Amplification Control (AC) del conjugado y de la reacción del sustrato.
M. tuberculosis complex (TUB)
rpoB Locus Control
rpoB wild type probe 1 (rpoB WT1) Control de amplificación (AC)
rpoB wild type probe 2 (rpoB WT2)
rpoB wild type probe 3 (rpoB WT3) Cuando el test es realizado correctamente, el amplicón control generado durante
rpoB wild type probe 4 (rpoB WT4) la amplificación se unirá a la zona de control de amplificación. Si la banda está
rpoB wild type probe 5 (rpoB WT5)
rpoB wild type probe 6 (rpoB WT6) ausente, indica que hubo errores durante la preparación de la amplificación, o
rpoB wild type probe 7 (rpoB WT7) indica la presencia de inhibidores de la PCR en el extracto de ADN. Esta banda
rpoB wild type probe 8 (rpoB WT8)
rpoB mutation probe 1 (rpoB MUT1) puede dar una señal débil.
rpoB mutation probe 2A (rpoB MUT2A)
rpoB mutation probe 2B (rpoB MUT2B)
rpoB mutation probe 3 (rpoB MUT3) M. tuberculosis complex (TUB)
katG Locus Control Esta zona hibridiza con amplicones generados a partir de todos los miembros
katG wild type probe (katG WT)
katG mutation probe 1 (katG MUT1) conocidos del complejo Mycobacterium tuberculosis. Si la banda TUB es negativa,
katG mutation probe 2 (katG MUT2)
la bacteria testeada no pertenece al complejo M. tuberculosis y no puede ser
inhA Locus Control
inhA wild type probe 1 (inhA WT1) evaluada por este test.
inhA wild type probe 2 (inhA WT2)
inhA mutation probe 1 (inhA MUT1)
inhA mutation probe 2 (inhA MUT2) Sondas rpoB , katG and inhA
inhA mutation probe 3A (inhA MUT3A)
inhA mutation probe 3B (inhA MUT3B) Estas zonas de reacción detectan la región de los genes respectivos documentando
colored mar ker por presencia o ausencia la resistencia a rifampicina y/o isoniazida. .Si un patrón
se desvía del patrón wild type indica resistencia de la cepa testeada.GenoType MTBDRplus v2.0 • Evaluación de la resistencia del complejo M. tuberculosis a Rifampicina e Isoniazida (Diferencia la R de bajo y alto nivel) • A partir de bacterias en medio sólido o líquido. • Muestras pulmonares con ZN + y ZN - • Controles: Control de conjugado (CC) Control de amplificación (UC) Control complejo MTBC (TUB) Control de zona del Locus para cada gen
GenoType MTBDRplus v2.0
GenoType MTBDRplus MTBC y su Resistencia a Rifampicina y/o Isoniazida
Ejemplos de resultados
GenoType MTBDRsl
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
EvaluaciónBases Moleculares de R en MTBC
Drug Gene Locus Gene function Percentage
of
Resistance
Isoniazid katG Catalase-Peroxidase 40 - 100 %
inhA Enoyl-ACP-Reduktase appr. 25 %
ahpC-Promoter Alkyl-Hydroxid-Peroxidase appr. 10 %
Rifampicin rpoB ß-Subunit of RNA- > 90 %
Polymerase
Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase appr. 95 %
Streptomycin rpsL ribosomal Protein S12 appr. 60 %
rrs 16S rRNA appr. 20 %
Ethambutol embB Arabinosyl-Transferase appr. 60 %
Chinolone gyrA DNA-Gyrase A appr.80-90%
Aminoglycoside rrs 16S rRNA No exact
Cyclic Peptide data
MTBDR plus
MTBDR slRegión de R a Fluoroquinolonas del gen gyrA
en MTBC
gyrAWT2
gyrAWT1 gyrAWT3
88 91 92 94
gyrAMUT1 gyrAMUT3A
gyrAMUT2 gyrAM UT3B
gyrAM UT3C
gyrAM UT3DRegión de R a Aminoglucósidos/P. cíclicos del gen rrs
en MTBC
WT1
1401 1402
…GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCC
AGTGGCCTAACCCTCGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTA
GCCGTACCGGAAGGT …
1484
WT2Región de R a Etambutol del gen embB
en MTBC
WT
306
embB MUT 1A
embB MUT 1BGenoType® MTBDRsl
Conjugate Control (CC)
Amplification Control (AC)
M. tuberculosis complex (TUB)
gyrA Locus Control (gyrA)
gyrA wild type probe 1 (gyrA WT1)
gyrA wild type probe 2 (gyrA WT2)
gyrA wild type probe 3 (gyrA WT3) Gen gyrA: resistencia a
gyrA mutation probe 1 (gyrA MUT1)
gyrA mutation probe 2 (gyrA MUT2) fluoroquinolonas
gyrA mutation probe 3A (gyrA MUT3A)
gyrA mutation probe 3B (gyrA MUT3B)
gyrA mutation probe 3C (gyrA MUT3C)
gyrA mutation probe 3D (gyrA MUT3D)
rrs Locus Control (rrs)
rrs wil d type probe 1 (rrs WT1)
rrs wild type probe 2 (rrs WT2)
Gen rrs: resistencia a péptidos
rrs mutation probe 1 ( rrs MUT1)
rrs mutation probe 2 (rrs MUT2)
cíclicos y aminoglucósidos
embB Locus Control (embB)
embB wild type probe 1 (embB WT1)
embB mutation probe 1A (embB MUT1A)
Gen embB: resistencia a
embB mutation probe 1B (embB MUT1B)
etambutol
colored mar kerGenoType MTBDRsl
MTBC y su resistencia a Fluoroquinolonas y/o Péptidos cíclicos y/o
EtambutolGenoType® Mycobacteria Direct
Purificación del ARN
Amplificación por NASBA
Hibridización reversa
EvaluaciónGenoType® Mycobacteria Direct • Detección simultanea del complejo M. tuberculosis y de 4 especies de Mycobacterium no tuberculosis: M. avium, M. intracellulare M.malmoense, y M. kansasii • A partir de la muestra clínica (pulmonar y extrapulmonar – excepto sangre), con ZN + ó ZN -. • Target: rRNA de Mycobacterias • Amplificación por reacción de NASBA • ARN Control Interno (AC) para monitorear los pasos de extracción y amplificación. • ARN Control Positivo incluído en el kit (*) • Tiempo total del ensayo: ~ 4 horas
GenoType® Mycobacteria Direct
Conjugate Control (CC)
Amplification Control (AC) Amplificación del
Control interno
M. avium
M. intracellulare
M. malmoense
M. kansasii
M. tuberculosis complexGenoType® Mycobacteria Direct
Ventajas
• Detección simultanea de 5 especies clínicamente relevantes
de mycobacterias a partir de muestras clínicas pulmonares y
extrapulmonares, ZN+ ó ZN-
• Control Interno y Control Positivo
• No requiere equipos costosos: TwinCubator®, termociclador
• Admite procesar pocas muestras (4 a 24)
• Aislamiento de RNA de alto grado de pureza para prevenir
inhibiciones de la reacción NASBA
• Tiempo del ensayo: 4 h
• Detección de CELULAS VIVAS → Conveniente en pacientes
tratadosGeno Type Performance
Geno Type Performance
Geno Type MTBDRplus v2.0
PerformanceGeno Type MTBDRplus v2.0
PerformanceAutomatización GT-48-Blot® or GT-20-Blot®
Algunas publicaciones… • AJRCCM January 2008 Rapid Molecular Screening for Multidrug-Resistant Tuberculosis in a High-Volume Public Health Laboratory in South Africa Marinus Barnard1, Heidi Albert2, Gerrit Coetzee3, Richard O’Brien2, and Marlein E. Bosman1 1National Health Laboratory Services (NHLS), Greenpoint, Cape Town, South Africa; 2Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), Geneva, Switzerland; and 3National TB Reference Laboratory, NHLS, Sandringham, Johannesburg, South Africa • JCM August 2006 Evaluation of the GenoType Mycobacteria Direct Assay for Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical Samples F. Franco-A´ lvarez de Luna, P. Ruiz, J. Gutie´rrez, and M. Casal* Microbiology Service, Reina Sofia University Hospital, and Mycobacteria Reference Center, Faculty of Medicine, Cordoba University, Cordoba, Spain • ERJ 2008 GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analysis D.I. Ling*, A.A. Zwerling* and M. Pai Dept of Epidemiology, Biostatistics and Occupational Health, McGill University, and Respiratory Epidemiology and Clinical Research Unit, Montreal Chest Institute, Montreal, QC, Canada • JCM February 2006 Evaluation of the New GenoType Mycobacterium Assay for Identification of Mycobacterial Species Cristina Russo,1 Enrico Tortoli,2* and Donato Menichella1 Microbiology Laboratory, Bambino Gesu` Hospital, Rome,1 and Regional Reference Center for Mycobacteria, Microbiology and Virology Laboratory, Careggi Hospital, Florence,2 Italy
Gracias por su atención!
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