Cultivo in vitro: propagación de plantas
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Cultivo in vitro: propagación de plantas
Hojas de crisantemo Plántula de crisantemo en envase
enraizando Magenta
Un cultivo in vitro es aquel realizado sobre un medio
nutritivo en condiciones estériles. Puede ser de: plantas,
semillas, embriones, órganos, explantos, células y
protoplástos.
Características del cultivo in vitro: Es empleado a microescala Hay optimización de las condiciones ambientales No se produce el patrón normal de desarrollo de una planta Hace factible la manipulación de las célula individuales o tejidos. Fundamental para transformación genética.
Pioneros del Cultivo in vitro
Tipos de Cultivo in vitro. Propagación y
regeneración de plantas
Plantas regeneradas
ORGANOGÉNESIS EMBRIOGÉNESIS
Callos Suspensión
de células
Protoplastos
Explantos:
trozos hojas, tallos, Microesporas/gametos
meristemos, etc.
Planta donante
Suspensión de células
Callos
Protoplastos
Microesporas/gametos
Explantos:
trozos hojas, tallos,
meristemos, etc.
Condiciones de los cultivos in vitro
¡¡ESTERILIDAD!!
Esterilización del material vegetal Se emplean medios nutritivos muy ricos, por lo que la esterilización de todo el material es esencial
TOTIPOTENCIA Capacidad de las células vegetales de regenerar un organismo completo. REPROGRAMACIÓN DESARROLLO Se altera el patrón de células que estaban completamente diferenciadas. COMPETENTES No todas las células que responden al cambio de programa de desarrollo.
Diferenciación Morfogénesis
Cambios de forma y función de Organización de la estructura de
orgánulos, células y tejidos tejidos y órganos. Arquitectura y
simetría de la planta
DESARROLLO
Crecimiento
Incremento biomasa por
división y elongación celular
Microescala
Auxinas Se transporta polarmente desde el ápice de parte aérea o raíz. El transporte de larga distancia se produce por el floema. Junto con las citoquininas son esenciales para la viabilidad de las plantas: no hay mutantes deficientes. La estructura química de las auxinas es diversa. Pueden acumularse en formas inactivas conjugadas a oligosacáridos y aminoácidos.
Auxinas naturales encontradas en plantas Auxinas sintetizadas químicamente
Proliferación de raíces secundarias
Control Alta [auxina]
[Auxina] > 10-8 M causa el inicio
de divisiones celulares en el
periciclo.
Regeneración de plantas
favoreciendo el enraizamientoInteracción con citoquinina y ácido
abscísico en la dominancia apical de tallo
Escisión del ápice causa
proliferación de tallos axilares
La auxina está implicada en la redistribución de las citoquininas
sintetizadas en la raíz hacia el ápice.
Escisión del ápice: mayor nivel de citoquinina en las yemas
laterales.
El ácido abscísico se acumula en las yemas laterales latentes. La
escisión del ápice disminuye su contenido.Citoquininas: descubiertas en cultivos in vitro Las se descubrieron al buscar factores que indujeran divisiones celulares y promoviesen el crecimiento de material vegetal. Se probaron multitud de substancias: extractos de levadura, jugo de tomate, etc. La leche de coco (rica en zeatina) fue muy efectiva, más en conjunción con auxina Skoog descubrió que DNA desnaturalizado de esperma de arenque era muy efectivo en promover división celular La kinetina fue la primera citoquinina identificada producida de síntesis por la degradación térmica de DNA
Diferentes tipos de citoquininas
Sintética Natural Sintética
Bencilamino
purina (BAP)Producción de callos por acumulación
de citoquininas: Agrobacterium
CALLO tejido desdiferenciado en
continua división.
AGALLA tumor producido por la
infección de Agrobacterium
tumefaciens por acumulación de
citoquininas y auxinasEn la infección, se produce la inserción de genes bacterianos en el genoma de la célula vegetal, portados en el T-DNA. Éstos codifican enzimas para la síntesis de dichas fitohormonas.
Proliferación de parte aérea
Control + CitoquininaDistintas moléculas tienen diferente actividad Auxinas y citoquininas tienen diferente nivel de actividad biológica según la molécula empleada: establecer la dosis.
Regeneración por organogénesis
Concentración de IAA (mg/L)
0 0,005 0,03 0,18 1,18 3,0
Concentración de kinetina (mg/L)
RAÍZ
0
CALLO
0,2
1,0
HOJARegeneración de plantas por organogénesis El callo se somete a una relación auxina/citoquinina baja, para inducir la formación de parte aérea. En condiciones de esterilidad, se secciona la parte aérea formada. Se transplanta a un medio de cultivo con una relación auxina/citoquinina alta, para inducir la formación de raíces. Una vez generadas raíces, se transfieren a un sustrato con alta capacidad de retención de agua (p. ej. turba). Las plántulas se cultivan en condiciones de humedad óptima para evitar su desecación, hasta que la raíz se afianza.
Protoplastos
Obtención enzimáticaDiversos materiales se pueden incorporar a un protoplasto: orgánulos, DNA plasmídico, bacterias, etc.
Variación somaclonal
Beneficiosa Perjudicial: indeseable en la generación de plantas transgénicas
Transformación de plantas: Agrobacterium Inserción del T-DNA con oncogenes y genes de metabolismo de opinas
Pioneros del desarrollo de vectores de
transformación basados en Agrobacterium
Jeff Schell Mark Van MontaguPlásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens
Estructura general del T-DNA LB RB
Genes vir NO se transfieren
SELECCIÓN DE
PLANTAS
TRANSGÉNICASSelección de trasngénicos con kanamicina
Sólo unas pocas
células son
transgénicas: varios
pasos de selecciónVectores binarios desarmados derivados del plásmido Ti de A. tumefaciens
LB Nos T MnSOD 35S 35S nptII 35S T RB Cebadores específicos utilizados Fragmento Cebador positivo Cebador negativo Rubisco tccctgtttcaaggaagc gtcgcataaaattgaaggag (349 pb) Rbcs01F Rbcs02R nptII gaagagcatcaggggctc gaagaactcgtcaagaaggc (317 pb) nptII01F nptII02R 35S tgccatcattgcgataaagg cctctccaaatgaaatgaac (234 pb) 35S01F 35S02R Nos term gaatcctgttgccggtcttgcg gcgggactctaatcataaaaac (127 pb) nos01F nos02R
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