Fertilización artificial aplicado a la conservación de la rana hojarasca desvanciente (Craugastor evanesco)

XVIII Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología (APANAC 2021)   ISSN: 2805-1807
                         Congreso Virtual, 23-25 de Junio, 2021, Panamá.

Fertilización artificial aplicado a la conservación de la
 rana hojarasca desvanciente (Craugastor evanesco)

                                                Samaniego, Diego
                               Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales
                                                Panamá, Panamá
                                          samaniego.33@hotmail.com

                                                      Arcia, Igli
                               Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales
                                                Panamá, Panamá
                                                  arciaigli@hotmail.com

                                                Della Togna, Gina
                               Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales
                                      Universidad Interamericana de Panamá
                                                Panamá, Panamá
                                             gina.dellatogna@uip.pa

                                                     Abstract
Within vertebrates, amphibians represent a highly diverse biological class facing the
most critical situation. Difficulties exist within captive breeding programmes that limit
the successful reproduction of these species and their subsequent reintroduction. The
priority of establishing ex situ conservation programmes has led to the creation of captive
conservation centres with the aim of keeping these species alive and reproducing genetically
viable specimens. Among these is the lack of knowledge about the general biology and
the specific reproductive characteristics of each species. Craugastor evanesco is one of
our endemic species that lives in the Atlantic basin and Coclé, barely described in 2010
and is very susceptible to infection of the pathogenic fungus Bd, with high probability of
disappearing in the wild. Because of the above, our overall goal is to develop an artificial
fertilization protocol applied to the conservation of the Vanishing Rainfrog (Craugastor
evanesco). For this purpose, the stimulation effectiveness of a single ovulatory dose should
be compared to the stimulation effectiveness using previous preparatory doses of lower
concentration followed by the administration of the higher concentration ovulatory dose.
Eggs obtained by stimulation with the most effective treatment (s) will be placed in a Petri
dish moistened with ARS. High quality sperm samples (motility and progressive motion >

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90%) shall be distributed over the egg mass using a pipette.

Keywords: Amphibian, artificial fertilization, eggs, hormones, reproduction.

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Dentro de los vertebrados, los anfibios representan una clase biológica de gran
diversidad que enfrenta la situación más crítica. Existen dificultades dentro de los
programas de reproducción en cautiverio que limitan la reproducción exitosa de
dichas especies y su posterior reintroducción. La prioridad de establecer programas
de conservación ex situ ha promovido la creación de centros de conservación
en cautiverio con la finalidad de mantener vivas a estas especies y reproducir
especímenes genéticamente viables Entre ellas, el poco conocimiento sobre la
biología general y las características reproductivas específicas de cada especie.
Craugastor evanesco es una de nuestras especies endémicas que habita en la
cuenca atlántica y Coclé, apenas descrita en el año 2010 y es muy susceptible a
la infección del hongo patógeno Bd, con alta probabilidad de desaparecer en vida
silvestre. Por lo mencionado anteriormente, nuestro objetivo general es desarrollar
un protocolo de fertilización artificial aplicado a la conservación de la rana hojarasca
desvaneciente (Craugastor evanesco). Para este fin se comparará la efectividad de
estimulación de una sola dosis ovulatoria vs la efectividad de estimulación utilizando
dosis preparatorias previas de menor concentración seguidas de la administración
de la dosis ovulatoria de mayor concentración. Los huevos obtenidos mediante
estimulación con el/los tratamientos más efectivos serán colocados en un plato
Petri humedecido con ARS. Las muestras de esperma de alta calidad (motilidad y
movimiento progresivo > 90%) serán distribuidas sobre la masa de huevos utilizando
una pipeta.

Palabras claves: anfibios, fertilización artificial, huevos, hormonas, reproducción.

1. INTRODUCCIÓN
   La clase “vertebrados” está experimentando declives poblaciones y extinciones[1], [2].
De estos, los anfibios se sitúan en la posición más delicada, con un aproximado de 41 a 53%
de especies amenazadas a nivel global[3].
   Este panorama enmarca la llamada “Crisis de extinción de anfibios”, ocasionando declives

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y extinciones de anuros, salamandras y cecilias distribuidos en diferentes ecosistemas de
nuestro planeta, excepto en el continente antártico[4], [5].
   Panamá se ubica en la región tropical mesoamericana, que alberga endemismo y
diversidad, con un total de 241 especies descritas de anfibios[3], [6]–[9]. La especie
Craugastor evanesco es de reproducción terrestre y desarrollo directo. Se distribuye en área
de El Copé y la vertiente atlántica de la serranía de Tabasará[10]. Su estatus de conservación
es de críticamente amenazada, por razones como la enfermedad causada por el hongo
Batrachochytrium dendrobatidis[11], destrucción de hábitat para agricultura y actividades
relacionadas a la explotación de recursos mineros[12].
   La especie se encuentra dentro de Proyecto de Rescate y Conservación de Anfibios, un
programa ex-situ de conservación y reproducción en cautiverio (CBP) [13]–[16].
   Las tecnologías de reproducción asistida se aplican para ayudar a reproducir especies
que no se reproducen fácilmente de manera natural en CBP´s y así, evitar su extinción [17]–
[19].

2. MÉTODO
A. SELECCIÓN
   Se seleccionarán individuos sexualmente maduros.
B. COLECTA DE ESPERMA
   Cuerpo del Texto: Se realizará tratamiento de estimulación hormonal para colecta de
orina espermática, vía inyección intracelómica del agonista de la hormona liberadora de la
gonadotropina GnRH-des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9.
   Se analizarán los parámetros espermáticos generales (concentración, motilidad,
movimiento progresivo, pH, osmolalidad, morfología).
C. COLECTA DE HUEVOS
   Se realizará tratamiento de estimulación hormonal vía inyección intracelómica del
agonista de la hormona liberadora de la gonadotropina GnRH-des-Gly10, D-Ala6, Pro-
NHEt9 y la gonadotropina coriónica humana (hCG).
   Se probará la efectividad de las hormonas y las concentraciones para la colecta de
huevos viables.
   Se comparará la efectividad de estimulación una dosis ovulatoria (Fig. 1) vs la efectividad
de dosis preparatorias previas de menor concentración seguidas de la dosis ovulatoria de
mayor concentración (Fig. 2).
   La dosis ovulatoria será administrada 72 horas después de la estimulación con la dosis
preparatoria para cada uno de los tratamientos (Fig. 2).

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   Figura 1: Experimento 1 con dosis              Figura 2: Experimento 2 con dosis preparatorias más dosis
               ovulatorias                                              ovulatorias.

D. MONITOREO Y EVALUACION DE HUEVOS
   Se regresarán a sus terrarios bajo constante observación. Si después de pasadas 24 horas
de la estimulación, la hembra no oviposita naturalmente, se procederá a realizar masajes
abdominales diarios por 5 días para estimular la oviposición.
   Los huevos colectados serán colocados en platos Petri ligeramente humedecidos con
ARS y protegidos de exposición a la luz. Se contará el número total de huevos por evento
de oviposición, se medirá el diámetro de los huevos y se evaluará la integridad de la capa
de gel.
E. FERTILIZACIÓN ARTIFICIAL
    Se realizará la técnica de fertilización artificial.
    Se seleccionarán los huevos obtenidos mediante estimulación con el/los tratamientos
más efectivos y serán colocados en un plato Petri humedecido con ARS. Las muestras de
esperma de alta calidad (motilidad y movimiento progresivo > 90%) serán distribuidas sobre
la masa de huevos utilizando una pipeta.

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3. RESULTADOS ESPERADOS
A. Estimulación hormonal
   • Primera identificación del efecto de la estimulación hormonal en la producción de
       huevos en C. evanesco.
   • Comparación del efecto estimulatorio hormonal entre las diferentes hormonas y
       concentraciones para la colecta de huevos en C. evanesco.
B. Caracterización de los huevos
   Primer análisis de las características de los huevos (cantidad, diámetro e integridad de
capa de gel) de la especie en cautiverio C. evanesco.
C. Protocolo de fertilización artificial
   • Primer estudio para la obtención de huevos fertilizados de forma artificial para esta
      especie.
   • Desarrollo de técnicas de reproducción asistida específica para C. evanesco.

4. IMPACTOS
   Los resultados de esta propuesta generarán conocimiento, actualmente inexistente,
que impactará directamente en el manejo de especies de anfibios en peligro de extinción
que se encuentran en cautiverio, y a su vez, producirá nueva información sobre la fisiología
reproductiva de estas especies en su medio natural.

Referencias
[1]  R. Dirzo, H. S. Young, M. Galetti, G. Ceballos, N. J. B. Isaac, and B. Collen, “Defaunation in the
     Anthropocene,” Science (80-. )., vol. 345, no. 6195, pp. 401–406, 2014, doi: 10.1126/science.1251817.
[2] G. Ceballos, A. García, and P. R. Ehrlich, “The sixth extinction crisis loss of animal populations and species,”
     J. Cosmol., vol. 8, no. November 2009, pp. 1821–1831, 2010, doi: 10.1016/j.patbio.2007.08.005.
[3] IUCN, “The IUCN Red List of Threatened Species.,” Version 2021-1, 2021. https://www.iucnredlist.org
     (accessed Jun. 07, 2021).
[4] K. C. Zippel and J. R. Mendelson III, “The amphibian extinction crisis: A call to action,” Herpetol. Rev., vol. 39,
     no. 1, pp. 23–29, 2008.
[5] A. Catenazzi, “State of the World ’ s Amphibians,” Annu. Rev. Environ. Resour., vol. 40, pp. 91–119, 2015, doi:
     10.1146/annurev-environ-102014-021358.
[6] Autoridad Nacional del Ambiente, Plan de Acción para la Conservación de los Anfibios en Panamá. Panama,
     2011, p. 28.
[7] K. R. Lips and M. A. Donnelly, “Lessons from the tropics,” Amphib. Declines Conserv. Status United States
     Species, no. June 2005, pp. 198–205, 2005, doi: 10.1525/california/9780520235922.003.0028.
[8] K. R. Lips, P. A. Burrowes, J. R. Mendelson, and G. Parra-Olea, “Amphibian population declines in Latin
     America: A synthesis,” Biotropica, vol. 37, no. 2, pp. 222–226, 2005, doi: 10.1111/j.1744-7429.2005.00029.x.
[9] S. M. Whitfield, K. R. Lips, and M. A. Donnelly, “Amphibian Decline and Conservation in Central America,”
     Copeia, vol. 104, no. 2, pp. 351–379, 2016, doi: 10.1643/CH-15-300.
[10] M. J. Ryan, J. M. Savage, K. R. Lips, and J. T. Giermakowski, “A new species of the Craugastor rugulosus

doi.org/10.33412/apanac.2021.3206
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       series (Anura: Craugastoridae) from west-central Panama,” Copeia, no. 3, pp. 405–409, 2010, doi: 10.1643/
       CH-09-154.
[11]   A. J. Crawford, K. R. Lips, and E. Bermingham, “Epidemic disease decimates amphibian abundance, species
       diversity, and evolutionary history in the highlands of central Panama,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 107,
       no. 31, pp. 13777–13782, 2010, doi: 10.1073/pnas.0914115107.
[12]   IUCN SSC Amphibian Specialist Group, “Craugastor evanesco,” The IUCN Red List of Threatened Species
       2019: e.T50922873A50922883., 2019. .
[13]   C. H. R. Lewis et al., “Conserving Panamanian harlequin frogs by integrating captive-breeding and research
       programs,” Biol. Conserv., vol. 236, no. October 2018, pp. 180–187, 2019, doi: 10.1016/j.biocon.2019.05.029.
[14]   B. Gratwicke and J. B. Murphy, “Amphibian Conservation Efforts at the Smithsonian ’ s National Zoological
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[15]   B. Gratwicke et al., “Evaluating the probability of avoiding disease-related extinctions of Panamanian
       amphibians through captive breeding programs,” Anim. Conserv., vol. 19, no. 4, pp. 324–336, 2015, doi:
       10.1111/acv.12249.
[16]   Qazi A. Hussain, “Global amphibian declines: A review,” Int. J. Biodivers. Conserv., vol. 4, no. 10, pp. 348–
       357, 2012, doi: 10.5897/ijbc12.008.
[17]   R. K. Browne, K. Wolfram, G. García, M. F. Bagaturov, and Z. J. J. . M. Pereboom, “Zoo-based amphibian
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[18]   J. Clulow, R. Upton, V. L. Trudeau, and S. Clulow, Eds., “Amphibian Assisted Reproductive Technologies:
       Moving from Technology to Application,” in Reproductive Sciences in Animal Conservation, vol. 1200, 2019.
[19]   G. Della Togna, L. G. Howell, J. Clulow, C. J. Langhorne, R. Marcec-Greaves, and N. E. Calatayud,
       “Evaluating amphibian biobanking and reproduction for captive breeding programs according to the Amphibian
       Conservation Action Plan objectives,” Theriogenology, vol. 150, no. xxxx, pp. 412–431, 2020, doi: 10.1016/j.
       theriogenology.2020.02.024.

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