Biología Celular Guía de Trabajos Prácticos - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Licenciatura en Ciencias Biológicas
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Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Licenciatura en Ciencias Biológicas Biología Celular Guía de Trabajos Prácticos Autoras: Dra Silvia González Dra Mirta Elena Grimaldi
UNIVERSIDAD DE BELGRANO LICENCIATURA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS DE BIOLOGÍA CELULAR DRA SILVIA GONZÁLEZ DRA MIRTA ELENA GRIMALDI AÑO: 2011
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Programa de la asignatura: UNIDAD I: Introducción a la célula eucariota: Composición química de las células: agua, minerales y biomoléculas (ácidos nucleicos; proteínas, hidratos de carbono y ácidos grasos). Organización interna de la célula eucariota. Comparación con células procariotas. UNIDAD II: Herramientas y metodologías para el estudio de la célula. Técnicas de microscopía óptica y electrónica. Fraccionamiento subcelular: principio de la centrifugación diferencial y en gradiente. Estrategias para separación y purificación de proteínas: cromatografía; electroforesis; marcación metabólica, utilización de radioisótopos para seguimiento de macromoléculas, etc. UNIDAD III: Biomembranas. Composición y propiedades. Rol de las proteínas en la actividad biológica de una membrana lipídica. Principios del transporte a través de membranas. Transporte activo y pasivo: transporte mediado por proteínas de membrana (canales, carriers, bombas); transporte en masa: endocitosis y exocitosis. “Lipid Rafts” UNIDAD IV: Matriz extracelular y uniones celulares. Uniones célula-célula y célula-matriz extracelular. Características y propiedades de los componentes de la matriz extracelular: glicosaminoglicanos, fibronectina, laminina, colágeno, elastina, etc. UNIDAD V: Citoesqueleto. Componentes: filamentos de actina, filamentos intermedios, microtúbulos. Funciones del citoesqueleto en la morfología y en la migración de las células, durante la división celular, en el transporte, etc. Diferenciaciones de membrana: microvellosidades, cilias, flagelos, etc. 2
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR UNIDAD VI: Organelas y otras estructuras intracelulares eucariotas. Sistema de endomembranas (retículo endoplasmático, complejo de Golgi, lisosomas), mitocondrias, peroxisomas, etc: estructura y funciones. Estructuras intracelulares no membranosas: ribosomas, centrosomas, proteasomas, etc: estructura y función. UNIDAD VII: Núcleo y cromatina. Núcleo celular: conceptos básicos. Envoltura nuclear: Transporte bidireccional citoplasma-núcleo. Cromatina: niveles de empaquetamiento. Cromosomas: Centrómero, telómeros, orígenes de replicación. Introducción a la citogenética: Cariotipo normal, bandeos, alteraciones estructurales y numéricas del cariotipo. UNIDAD VIII: Ciclo celular. Interfase: replicación del genoma celular. Expresión génica: Transcripción. Procesamiento del ARN. Traducción. Procesamiento y tránsito de proteínas dentro de la célula. Mitosis. Regulación del ciclo celular en mamíferos: Cdks y ciclinas. Factores de crecimiento y mitógenos. Protooncogenes y genes supresores de tumores. Cáncer. Apoptosis. UNIDAD IX: Introducción a la señalización celular. Tipos de comunicación celular. Receptores de la superficie celular. Receptores intracelulares. Vías de señalización celular: Segundos mensajeros y moléculas señalizadoras intracelulares. Vías del AMPc y de los fosfoinosítidos. UNIDAD X: Introducción al sistema inmune Respuesta inmune innata y adquirida. Sistema del complemento. Respuesta humoral y celular. Repertorio de linfocitos T. Clases de inmunoglobulinas y funciones. Moléculas MHC y presentación del antígeno. 3
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Unidad I: Introducción a la célula eucariota Trabajo Práctico N0 1: Cuestionarios de revisión de conceptos básicos Parte A: Composición química de las células 1) Los elementos minerales que forman parte de la materia viva se clasifican como macro y micronutrientes. ¿Con qué criterio: de tamaño, de abundancia o de grado de importancia? 2) ¿Cuáles son las propiedades del agua que le permiten ser un excelente medio interno para los procesos metabólicos de animales y plantas? 3) Mencione el monómero y el tipo de unión entre monómeros de cada clase de biomolécula. ¿Todas tienen estructura polimérica? 4) Describa los niveles de estructura que puede alcanzar una proteína. ¿Son independientes entre sí? ¿Por qué? 5) ¿Qué nivel de estructura debe adquirir una proteína para ser activa? ¿Por qué? 6) ¿Cuáles son los efectos de desnaturalizar y de hidrolizar una proteína? ¿Cómo pueden lograrse la desnaturalización y la hidrólisis? ¿Alguno de estos procesos es reversible? 7) ¿En qué se diferencian una enzima y una proteína fibrosa como el colágeno? 8) Respecto a la estructura del ADN señale cuáles de los enunciados son verdaderos y, de ellos, cuál responde a la denominada regla de Chargaff. Justifique: a) El contenido de A +T en una hebra es igual al contenido de G+C en la hebra complementaria. b) El contenido de A en una hebra es igual al contenido de T en la hebra complementaria. c) El contenido de A +T+C+G en una hebra es igual al contenido de A+T+ G+C en la hebra complementaria 4
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR d) El contenido de G en ambas hebras es igual al contenido de C en ambas hebras e) El contenido de A +G en una hebra es igual al contenido de T+C en la hebra complementaria. f) El contenido de A+G en ambas hebras es igual al contenido de T+C en ambas hebras 9) Compare el ADN y el ARN estructural y funcionalmente por medio de una tabla. 10) Siendo los lípidos un grupo muy heterogéneo de macromoléculas, ¿en base a a qué criterio se agrupan entre sí? ¿Que subgrupos se establecen dentro de los lípidos y qué criterio se utiliza para dicha sub-clasificación? 11) ¿Cómo pueden disponerse los lípidos anfipáticos en un medio acuoso? 12) Mencione tres funciones posibles de los hidratos de carbono e indique tres ejemplos de glúcidos que desempeñen cada función. 13) Describa cómo se clasifican los hidratos del carbono de acuerdo al número de monómeros que presenta la molécula. De ejemplos. Parte B: Características generales de las células 1) ¿Qué postula la Teoría Celular? ¿Por qué es una teoría? 2) ¿Cuáles son las propiedades que hacen que pueda decirse que una célula está viva? 3) ¿Cuáles son las propiedades que hacen que pueda decirse que un virus no está vivo? 4) ¿En base a qué criterios se han clasificado a los seres vivos en 5 reinos? ¿Sobre qué base dicha clasificación fue paulatinamente reemplazada por la clasificación en 3 dominios? 5) Complete el siguiente cuadro indicando si cada estructura se encuentra “siempre”, “en algunos casos” o “nunca”: 5
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Estructura Célula procariota Célula eucariota Núcleo Membrana plasmática Pared celular Citoesqueleto Cromosoma Citoplasma ADN Ribosomas Plásmido Mitocondria Cloroplasto Lisosomas Fosfolípidos Colesterol 6) ¿Una célula procariota puede respirar? ¿Puede fotosintetizar? ¿De qué manera? 7) Existen diferentes maneras de catabolizar los hidratos de carbono. ¿Cuál o cuáles pueden llevar a cabo las células procariotas y cuáles las eucariotas? 8) Si las proteínas cuyo destino es ser secretadas al medio exterior se sintetizan y maduran a través de un sistema de membranas internas en células eucariotas, ¿eso significa que las células procariotas -que carecen de membranas internas- no pueden secretar proteínas? Explique. 9) La fotosíntesis es un proceso de elaboración de hidratos de carbono que sirven para el crecimiento del organismo. ¿Cuáles organismos (de qué reinos) pueden llevarla a cabo? ¿Es indispensable la presencia de cloroplastos? ¿Por qué? ¿Cómo crecen los organismos que no pueden fotosintetizar? 10) ¿Cuáles son las diferencias entre una bacteria y una célula animal a nivel genético? 6
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Trabajo Práctico N0 2: Repaso de conceptos en base a la lectura de un artículo de revisión Objetivo: Repasar conceptos adquiridos previamente acerca de las biomoléculas y su modo de interacción. Consigna: Lea el artículo "Complementaridad intergametos: Breve revisión" teniendo en mente lo que usted sabe acerca de la estructura y función de las biomoléculas. a) Tome nota de las biomoléculas que se mencionan e identifíquelas dentro del grupo correspondiente. b) Describa con un esquema sencillo la interacción entre la membrana del espermatozoide y la membrana del ovocito en cuanto a las biomoléculas intervinientes. c) ¿Cuál es la función de los hidratos de carbono que se destaca en este trabajo? d) ¿A qué se llama "zona pelúcida"? 7
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR UNIDAD II: Herramientas y metodologías para el estudio de la célula Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Usted trabaja en un laboratorio que dispone de: Cuba de electroforesis analítica de proteínas Microscopio óptico de campo claro Reactivos para inmunohistoquímica Dispositivo de diálisis Columnas de intercambio iónico (carboximetil celulosa y sefarosa). Reactivos para precipitación con solventes poco polares Ultracentrífuga Columnas de afinidad Microcentrífuga Columnas de filtración molecular Si debe determinar cómo depende la actividad enzimática de una enzima citosólica hepática de rata (cuyo pI
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR La forma de la red de filamentos de actina citoplasmáticos. El movimiento de los cloroplastos en respuesta a la luz en hojas de Elodea. 4) ¿Para qué sirven las siguientes técnicas? Método de Feulgen Técnica de ácido-peryódico-Schiff (“PAS”) Tinción con colorante rojo Sudán Método de Biuret (CuSO4/NaOH) Tinción con colorantes metacromáticos (ej: azul de toluidina) Marcado con radioisótopos y radioautografía (“Pulse-chase”) Inmunohistoquímica 5) ¿Cuáles de las siguientes técnicas pueden emplearse para estimar la masa molecular de una proteína? ¿Cuál de ellas brinda la mayor exactitud? Western Cromatografía de filtración en gel Ultracentrifugación diferencial Cromatografía de afinidad Ultracentrifugación en gradiente de densidad SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida (sin SDS) Trabajo Práctico N0 2: Interpretación de un texto científico de divulgación Consigna: Lea el texto “La huella genética del DNA (DNA Fingerprint)” y responda lo siguiente: 1) ¿A partir de qué técnica más antigua se desarrolló la de huella genética de ADN? 2) ¿Con qué fines prácticos puede emplearse? 3) ¿En qué principios biológicos se basa? ¿Cualquier tipo de ADN es útil para llevarla a cabo? ¿Por qué? 9
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 4) ¿Con qué otra técnica debe combinarse la de DNA Fingerprint para aumentar su sensibilidad? ¿En qué casos esto es necesario? Trabajo Práctico N0 3: Resolución de problemas inspirados en situaciones de laboratorio Problema 1: El gen de una proteína receptora de membrana plasmática humana-que en su forma funcional es un homodímero que tiene un peso molecular total de 200 kDa- se introduce en un vector de expresión y éste es transfectado en células de mamífero en cultivo. Dos días después se aisla la fracción microsomal de las células cultivadas. Alícuotas de la fracción se tratan con SDS y se corre un gel de poliacrilamida 5%. Se realiza la transferencia a una membrana de nitrocelulosa y ésta se revela con un anticuerpo monoclonal específico. En lugar de una banda se obtienen dos: una de 200 kDa y otra de 160 kDa. Ante este resultado inesperado, y para dilucidar la razón, se realizan otros dos tratamientos en paralelo con el anterior: SDS + β-mercaptoetanol, SDS + β- mercaptoetanol + endoglicosidasa H y se repite todo el procedimiento de transferencia y revelado. Los resultados obtenidos esta vez son los siguientes: SDS -> 1 banda de 160 kDa y 1 banda de 200 kDa SDS + β-mercaptoetanol ->1 banda de 100 kDa y 1 banda de 80 kDa SDS + β-mercaptoetanol + endoglicosidasa H -> 1 banda de 80 kDa Responda: a- ¿Por qué método se aísla la fracción microsomal? ¿En qué consiste esta fracción? b- ¿Cómo se llama el procedimiento que se describe paso a paso en el segundo párrafo? c-Proponga una explicación que dé cuenta de todos los resultados. 10
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Problema 2: Usted trabaja en un laboratorio de biología molecular bien equipado y debe investigar si el nivel de expresión de una determinada proteína citosólica guarda relación o no con las condiciones de estrés hipóxico (bajo suministro de O2). Para ello elige trabajar sobre una línea de células de mamífero cultivadas in vitro que expresa dicha proteína a un nivel mínimo basal (pero detectable) en condiciones de suministro normal de O2. De la proteína se conoce que posee estructura terciaria globular y que su peso molecular aproximado es de 100 kDa. Suponga que, entre otras cosas, dispone de variadas columnas de cromatografía, incluyendo una de afinidad específica para esta proteína, un anticuerpo monoclonal (específico contra esta proteína) y el kit de detección correspondiente, reactivos para inmunohistoquímica de fluorescencia, un flujo laminar, un protocolo de hipoxia sobre células en cultivo puesto a punto, microscopios óptico de campo claro y de fluorescencia, kits de inmunoblotting (de electroforesis en gel y de transferencia), máquina de PCR, ultracentrífuga, microcentrífuga de mesada, baño con temperatura regulable y estufa de cultivo. a-Enumere, en el orden correspondiente, los métodos que emplearía para cumplir su objetivo y los resultados que espera obtener en cada paso (no describa las técnicas, sólo menciónelas). b- En caso de obtener una variación significativa en el nivel de expresión en condiciones de hipoxia, ¿cómo analizaría si ésta se debe a un cambio en la cantidad de ARN mensajero sintetizado o simplemente a un cambio en la estabilidad de la proteína? Problema 3: Al realizar un SDS-PAGE de un receptor de membrana purificado se obtienen 4 bandas: de 140, 110, 90 y 70 kDa. Cuando las muestras fueron sometidas a SDS + mercaptoetanol, en el gel se distinguen 3 bandas: de 110, 90 y 70 kDa. ¿Cómo es posible que, siendo que el mercaptoetanol separa subunidades ligadas por puentes disulfuro, con su acción desaparece una banda en lugar de aparecer otra? 11
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Problema 4: Un anticuerpo soluble del cual no se conoce su peso molecular (PM) ni su carga pero sí el antígeno al cual se une específicamente fue purificado por cromatografía, empleando como herramienta el antígeno purificado. Al realizar un SDS-PAGE, sin mercaptoetanol se obtuvo una sola banda muy pesada. Con mercaptoetanol (y SDS) se obtuvieron dos bandas y aunque no fue posible estimar pesos moleculares concretos por falta de controles, una de las bandas corrió como si tuviera el doble de PM que la otra. a-¿Qué tipo de cromatografía se utilizó para la purificación? b-Suponiendo que el anticuerpo no está glicosilado, indique 3 estructuras cuaternarias compatibles con los resultados. Trabajo Práctico N0 4: Análisis comparativo y crítico de artículos de investigación Objetivo: Comprender, comparar y criticar trabajos metodológicos. Conocimientos previos necesarios: Fundamentos y aplicaciones de técnicas de Northern y Western-blot. Consigna: Responda el cuestionario en base a la lectura de los siguientes trabajos: Revisión: “DNA microarray technology and its applications in cancer biology” Trabajo original: “A rapid microwell fluorescence immunoassay for celular protein detection” Trabajo original: “Rapid protein separations in ultra-short microchannels: microchip sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing” 1) ¿Con cuál/es de las técnicas descriptas se puede: a- evaluar el nivel de expresión de determinado/s gen/es? b-separar proteínas según su peso molecular? c-estimar el nivel de biosíntesis de una proteína? 2) ¿Cuál de las técnicas serviría para mejorar la tradicional técnica de SDS- PAGE? ¿Y cuál la de Northern-blot? 12
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 3) Uno de los trabajos (¿cuál?) sostiene que la técnica descripta es mejor que la de Western-blot en varios aspectos. Discuta esta afirmación. 4)¿Cuáles serían las ventajas de separar una mezcla de proteínas por SDS- PAGE en microcanales en lugar de hacerlo en las extensas láminas de gel tradicionales? 5) ¿Cuáles son las utilidades del "DNA microarray" en el estudio del cáncer? 13
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Unidad III: Biomembranas Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Enumere las principales propiedades de las biomembranas y explíquelas. 2) ¿En qué consiste la difusión simple? ¿Cómo se denomina el desplazamiento de agua por difusión simple? 3) ¿Cuáles son los fosfolípidos de membrana y qué funciones cumplen? 4) ¿Cómo pueden extraerse de la membrana plasmática las proteínas integrales? ¿Y las periféricas? ¿Por qué? 5) ¿Cuál es el esteroide presente en las membranas animales? ¿Cuáles son los esteroides presentes en células pertenecientes a los reinos Plantae y Fungi? ¿Qué ocurre en relación con esto en el reino Monera? 6) ¿Cuáles son las funciones de los carbohidratos en la superficie externa de la membrana plasmática? ¿Qué determinan los carbohidratos de superficie de eritrocitos? 7) ¿En qué se diferencian un transporte pasivo de uno activo? ¿Y uno activo primario de uno activo secundario? 8) ¿Qué tipos de canales de iones conoce? ¿en cuáles aspectos se parecen y en cuáles se diferencian? 9) ¿Cuáles son los pasos de la endocitosis mediada por receptor? ¿La acción de qué organela es necesaria luego del ingreso de la partícula? 10) Realice un cuadro comparativo entre los distintos transportes en masa y otro entre los distintos tipos de transporte molecular. 11) Cómo pueden salir de la célula hacia el medio extracelular y cómo pueden entrar a la célula las siguientes moléculas o partículas: a) Na+ b) K+ c) una glicoproteína d) un aminoácido e) un virus 14
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR f) dióxido de carbono 12) Cómo pueden entrar a la célula las siguientes moléculas o partículas: a) Ca2+ b) Cl- c) LDL (lipoproteína que transporta colesterol) d) un monosacárido e) una bacteria f) un esteroide 13) Explique cómo se produce la absorción de glucosa por parte del epitelio intestinal a nivel de los transportes que tienen lugar en la membrana apical y en la basal. 14) Describa el funcionamiento de la bomba de Na+/K+. ¿Qué transporte y qué propiedades de la membrana plasmática dependen de ella? 15) ¿En qué consiste la asimetría de la membrana? ¿Y la fluidez? 16) Dadas las siguientes características de la membrana plasmática: permeabilidad selectiva asimetría heterogeneidad fluidez explique para cada una de ellas: Su origen (es decir, con qué característica/s estructural/es se relaciona) Su significado funcional (es decir, qué consecuencias tiene en las funciones de la membrana). 17) Investigue y enumere las moléculas de transporte involucradas en los pasos de transmisión del impulso nervioso a través de una terminal sináptica. Señale cuáles de los modos de transporte mencionados son activos y cuáles pasivos. Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un trabajo científico Consigna: Lea el trabajo de revisión: “Multiple molecular mechanisms for multidrug -resistance transport” y responda: 15
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 1) ¿Qué distintos tipos de transportadores multidroga se conocen? 2) ¿Para qué sirven? ¿Cómo son en cuanto a su especificidad? 3) ¿En qué se diferencian los transportadores ABC (ATP-binding cassette de los otros descriptos en el trabajo? 4) ¿Cuáles tipos pueden estar presentes en células eucariotas? 5) ¿Cuál es el desafío que la existencia de estos transportadores plantea a la industria farmacéutica? 6) ¿Qué estrategias se intentaron para superar este problema? ¿Qué resultado han tenido? 16
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR UNIDAD IV: Matriz extracelular y uniones celulares Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Cuáles son las funciones genéricas de la MEC? 2) Describa la estructura de una fibra de colágeno. 3) Diferencie las funciones de las distintas proteínas que forman parte de la MEC? ¿Existe la proteína acomplejada? ¿En qué componente? 4) ¿Cuál es la composición de la lámina basal? ¿Por que se dice que es una especialización de la MEC? 5) ¿Qué es un proteoglucano? ¿Qué funciones cumple? 6) ¿Qué tipo de componente es el ácido hialurónico? ¿En qué consiste el agrecán? 7) ¿Cuál es la propiedad de los proteoglucanos que más contribuye a su función? 8) Investigue cuáles son las características de la MEC de diferentes tejidos (hueso, cartílago, tejidos conjuntivo y epitelial). Justifique en base a la composición. 9) ¿Qué tres tipos de moléculas intervienen en toda unión de anclaje entre células y MEC? 10) Realice un cuadro comparativo entre los distintos tipos de proteínas de adhesión. 11) ¿Cuál es el único tipo de proteína de adhesión cuyo mecanismo de unión es independiente de Ca2+? 12) ¿Cuáles tipos de proteína de adhesión intervienen en la adhesión de células migratorias a la MEC y cómo lo hacen? ¿Qué tipo de uniones poco estables se desarrollan? 13) ¿Qué significa que CAM y cadherinas median mayormente uniones homofílicas y las selectinas, heterofílicas? 14) ¿Qué uniones de anclaje y comunicantes caracterizan a las células epiteliales? Describa sus funciones. 17
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 15) Compare las uniones comunicantes en cuanto al tipo celular en que se encuentran, estructura y función. 16) ¿Cómo se impermeabilizan los epitelios intestinal, de vejiga urinaria y los conductos glandulares para impedir que el contenido de la luz del órgano se infiltre en los espacios intercelulares? 17) ¿Cuáles son las diferencias entre desmosomas y hemi- desmosomas? 18) ¿Cómo está formada la banda o cinturón de adhesión? ¿Es lo mismo que la unión estrecha? 19) ¿Por qué se dice que la lámina basal es una especialización de la MEC? Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un trabajo científico Objetivo: Aprender a reconocer problemas actuales dentro de la biología celular y analizar sus posibles interpretaciones. Consigna: Lea el trabajo acerca del fenómeno de entosis y responda las preguntas. 1) En este artículo aparece claramente la diferencia entre las evidencias experimentales de un fenómeno celular y sus posibles interpretaciones. Ratifique lo dicho con los elementos expuestos en esta revisión. 2) ¿Cuáles uniones entre células y entre células y MEC se mencionan y qué relevancia tendrían en la entosis? 18
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Unidad V: Citoesqueleto Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Qué características comparten todos los componentes del citoesqueleto? ¿Todos ellos se polimerizan y despolimerizan fácilmente? 2) ¿Cómo se determina la presencia de citoesqueleto en cortes de tejido? 3) Diferencie los filamentos de actina corticales de los transcelulares y de los musculares en cuanto a sus funciones. 4) ¿Con qué proteína interactúa la actina para llevar a cabo la contracción muscular? ¿Qué proteína regula dicha unión? 5) ¿Cuál es la función de los filamentos intermedios? 6) Diferencie los 5 tipos de filamentos intermedios en cuanto a composición química y distribución tisular. ¿Cuál de ellos tiene localización nuclear? 7) ¿Desde dónde parte la polimerización de los microtúbulos? ¿Cómo ocurre? 8) ¿Cuáles son los diferentes tipos de microtúbulos? ¿En qué se diferencian? ¿Cuál es la función de cada uno? 9) ¿Por qué la endocitosis y la mitosis son procesos que requieren gasto de energía? 10) Realice un cuadro comparativo entre los componentes del citoesqueleto en cuanto a: proteínas que los componen polaridad estabilidad espesor de las fibras localización celular funciones 11) Investigue de qué manera la droga citocalasina B produce la despolimerización de los filamentos de actina 19
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 12) ¿Las funciones de los filamentos de actina siempre implican movimiento? Si no es así, dé algún ejemplo. 13) ¿Por qué se usa la identificación de filamentos intermedios para determinar el origen tisular de algunos tumores? 14) Compare la estructura interna de los cuerpos basales de cilias, de los centríolos y de los axonemas de los flagelos. 15) Mencione tres proteínas accesorias motoras de los microtúbulos y describa su función. 16) Investigue por qué drogas como la colchicina, la vincristina, la vinblastina y el taxol inhiben la división mitótica. ¿Todas ellas actúan de igual manera? Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un trabajo científico Consigna: Lea el artículo "Dynamics and mechanisms of the microtubule plus end" y responda. 1) ¿En qué consiste la inestabilidad dinámica de los microtúbulos? 2) ¿Qué ocurre cuando el microtúbulo se ancla a una proteína o estructura celular? 3) ¿Podrían los microtúbulos mover estructuras celulares sin necesidad de proteínas motoras? Justifique su respuesta. 4) ¿Cuál es el papel del GTP en la inestabilidad dinámica? 5) ¿Qué proteínas que se unen a los extremos más y menos se conocen y cuál es su función? 20
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Unidad VI: Organelas y otras estructuras intracelulares eucariontes Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Cuáles organelas eucariontes están rodeadas por una membrana simple y cuáles por doble membrana? Mencione a menos tres estructuras internas que no se encuentran rodeadas por membrana. 2) Complete el siguiente cuadro con cruces: Reino: Monera Protista Fungi Plantae Animalia Ribosomas R.E.L. Lisosomas Vacuolas Mitocondrias Plástidos Centrosoma 3) ¿Por qué se dice que el retículo endoplasmático, el complejo de Golgi y los lisosomas forman parte de un solo sistema de membranas internas? Describa las funciones de cada parte del sistema. 4) ¿Cuáles son las proteínas y los lípidos que se sintetizan y procesan a través del sistema de endomembranas? 5) ¿Por qué se dice que el complejo de Golgi “clasifica” proteínas y lípidos? 6) En un examen de Biología Celular un alumno respondió a la pregunta de cuál es la función de los lisosomas lo siguiente: “La función de los lisosomas es degradar las proteínas lisosomales que le envía el aparato de Golgi dentro de vesículas”. Corrija el concepto equivocado. 7) Complete en qué compartimiento celular tiene lugar cada uno de los siguientes procesos metabólicos: Glucólisis:_________________________ β-oxidación de ácidos grasos:___________________ 21
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Peroxidación de subproductos metabólicos tóxicos:____________________ Cadena respiratoria:____________________________ Fase bioquímica ú oscura de fotosíntesis:_________________ Ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos:________________________ Síntesis de esteroides:____________________________ Biotransformación de sustancias hidrofóbicas tóxicas:__________________ 8) ¿Cuál es el producto esencial que se produce en las mitocondrias y cuál el subproducto? ¿Qué necesitan consumir para funcionar? 9) Responda la pregunta anterior pero referida a los cloroplastos. 10) Describa la estructura de una mitocondria. ¿Con qué tipo de microscopio se puede observar? 11) ¿Qué funciones puede tener una vacuola? ¿Y un peroxisoma? 12) ¿Qué tipo de organela es esperable que se encuentre más activa en los siguientes tipos celulares? Célula glandular animal productora de una hormona proteica glucosilada:____________________ Macrófago en circulación sanguínea:______________________ Célula del mesófilo de la hoja de una planta:____________________ Fibra de músculo estriado animal:_________________________ Célula hepática animal:______________________ 12) Compare las fracciones lisa y rugosa del retículo endoplásmico en cuanto a estructura y funciones. 13) Una proteína que se sintetiza en ribosomas anclados al retículo endoplasmático se ancla en la membrana del mismo a través de dos dominios transmembranales hidrofóbicos. ¿Qué destinos finales podría presentar? 14) ¿En qué compartimientos celulares tiene lugar la glicosilación de proteínas? ¿Cómo se relaciona el hecho de que todos los oligosacáridos de las glicoproteínas de membrana plasmática quedan orientados hacia el medio extracelular con su proceso de formación? 15) ¿Cómo se relaciona la endocitosis con la función lisosomal? 22
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un artículo científico Objetivo: Reflexionar acerca de las nuevas evidencias disponibles acerca de la relación estructura-función de una organela conocida. Consigna: Lea el trabajo "Papel de nuevas proteínas mitocondriales" y responda. 1) ¿Qué función desempeñan las mitocondrias de animales homeotermos además de la producción de ATP? ¿Cuál es la condición necesaria?¿Existe relación clara entre la actividad de UCP y termogenicidad? 2)¿En qué tejidos humanos es importante esta función? 3) ¿Qué son los fenómenos de fusión y fisión mitocondrial? 4)¿Qué patologías se relacionarían con alteraciones en actividad de oxidación mitocondrial? 5) La reducción en la expresión de Mfn 2 en células musculares en cultivo se asoció por un lado con distribución mitocondrial desagregada y por otro con menor capacidad de oxidación mitocondrial de sustratos. ¿Esto significa que la desagregación de mitocondrias causa menor eficiencia en funcionamiento mitocondrial? 23
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Unidad VII: Núcleo y cromatina Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Describa las características de la envoltura nuclear. ¿Por qué sólo existe durante interfase? 2) ¿Qué tipos de transportes se llevan a cabo a través de los poros nucleares? ¿Qué proteínas intervienen? 3) ¿Cuál es el contenido del núcleo interfásico? 4) En la especie humana (2n=46) ¿Cuántas moléculas de ADN contiene cada núcleo? ¿Varía dicho número durante la interfase? ¿Por qué? 5) ¿Cuáles son los dos principales procesos de biosíntesis que tienen lugar en el núcleo? ¿En qué etapa del ciclo celular sucede cada uno? 6) Describa la estructura molecular de un nucleosoma. ¿Qué fuerzas de unión lo mantienen armado? 7) Describa los niveles de empaquetamiento de la cromatina que podrían estar presentes en un núcleo interfásico. 8) ¿Cuál es el máximo nivel de empaquetamiento al que puede llegar la cromatina? ¿Con cuales modelos de plegamiento estructural pretenden explicarse? ¿En qué etapas del ciclo celular tendrían lugar dichos plegamientos? 9) ¿Cuáles son las tres características principales estructurales y funcionales de un cromosoma mitótico? ¿Se encuentran presentes también durante la interfase? ¿Por qué? 10)¿En qué consiste el nucleolo? ¿Qué moléculas de cromatina participan de él? ¿Cuál es su función? 11) Clasifique los cromosomas de acuerdo a su estructura. Indique, en el cariotipo humano, cuáles son de cada tipo. 24
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Unidad VIII: Ciclo celular Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Mencione las etapas del ciclo celular de una célula humana (2n=46) que se divide por mitosis y descríbalas. Aclare para cada una de ellas cuántas moléculas de ADN y cuántos cromosomas existen, si las moléculas de ADN está o no condensadas y si los cromosomas está o no duplicados. 2)Indique en qué fase del ciclo celular ocurre cada uno de los procesos siguientes: Separación de cromátides hermanas Producción de proteínas de secreción Síntesis de histonas Expresión de genes ribosomales Descondensación de cromosomas Duplicación de centríolos Armado del huso mitótico 3) Para una célula 2n=20 complete: Valor C en G1 y en profase mitótica Número de cromosomas en G1 y G2 Número de cromátides en G1 y metafase Número de pares de cromosomas en G1 y en citocinesis 4) Enumere los principales puntos de chequeo del ciclo celular, los parámetros que se controlan y su importancia. 5) El gen p53 es un gen supresor de tumores. Indique su papel en el control del ciclo celular. ¿Qué sucede si se encuentra mutado uno o ambos alelos en una célula somática? 6) Caracterice la replicación del ADN en base a sus propiedades (caracteristicas del mecanismo, tipo de proceso metabólico, fase en que ocurre, moléculas que se requieren para llevarla a cabo). 25
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 7) Una célula 2n=32 comienza su ciclo celular. Indique cuál será su constitución cromosómica en cuanto al número haploide/diploide, número de cromosomas y número de moléculas de ADN: Al inicio de G1 Al inicio de G2 En metafase mitótica En cada una de sus células hijas al inicio de G1 tras la mitosis 8) ¿Qué entiende por expresión génica? ¿Qué procesos comprende, en qué compartimientos celulares y en qué fases del ciclo celular los ubica? ¿Cuáles son sus productos? 9) Enumere los distintos tipos de ARN que se transcriben y describa sus funciones ¿Cuáles de ellos deben asociarse a proteínas para ser activos? 10) Diferencie un gen codificador de proteína eucariota de un procariota. 11) ¿En qué se diferencian los genes de ARN ribosomales de los de proteínas en células eucariotas? 12) ¿Qué elementos requiere el proceso de transcripción? 13) ¿Cuáles partes del gen se transcriben y cuales no? 14) ¿Cuáles son los procesamientos del ARN mensajero transcripto primario eucariota? 15) ¿En qué consiste básicamente el splicing? 16) ¿Dónde se sintetiza y se procesa el ARN ribosomal y se forman las subunidades ribosomales? 17) Describa someramente el proceso de traducción mencionando todas las moléculas y complejos moleculares necesarios. 18) ¿En qué se diferencia la síntesis de una proteína citosólica de una de membrana plasmática? 19) ¿Cuáles son los tres modos posibles de desencadenamiento de apoptosis? 20) Realice un cuadro comparativo entre apoptosis y necrosis 21) Señale los cambios morfológicos sucesivos que sufre una célula apoptótica. 22) ¿Cuáles son las vías en las cuales son efectores el citocromo C y la proteína AIF? ¿Cuáles son los efectos de dichas moléculas al ser liberadas en el citosol? 26
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 23) ¿En qué consiste la cascada de activación de las caspasas? 24) ¿Cuáles son los nexos entre el control del ciclo celular y la apoptosis? Explique. Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un artículo científico Consigna: Lea el trabajo “El ciclo celular” y realice los puntos 1 a 3 a continuación. 1) Realice un esquema circular del ciclo celular indicando en cada etapa los sucesos principales y los puntos de control principales. 2) Describa las características principales del ciclo celular en cuanto a su progresión en el tiempo (duración, control interno de las transiciones entre etapas). 3) Describa el punto de control principal en G1 y el papel de las proteínas Rb y p53. 27
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Unidad IX: Introducción a la señalización celular Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Cuáles son las vías de comunicación intercelular en organismos pluricelulares? Diferéncielas. 2) ¿Cuáles son los mecanismos de acción posibles para una molécula señal hidrofóbica y para una molécula inductora hidrofílica? Dé ejemplos de cada tipo de molécula. Indique la ubicación celular de los receptores en cada caso. 3) Esquematice los componentes moleculares de las vías de transducción de señales que involucran la fosfoquinasa A por un lado y la fosfolipasa C por otro. Señale los efectos finales de cada una de las vias. 4) ¿Qué es una proteína G? ¿Cuál es su función? ¿Qué tipos existen? 5) ¿Por qué se dice que a lo largo de la transducción la señal se amplifica? 6) Describa el mecanismo de acción de una hormona esteroidea sobre su célula blanco. 7) Describa los diferentes tipos de receptores de superficie. 8) Indique el mecanismo de acción del óxido nítrico 28
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Trabajos prácticos de integración y aplicación de conceptos de toda la asignatura Esta sección tiene como objetivo integrar en un análisis conjunto todos los conceptos trabajados en la asignatura y aplicarlos en dos tipos de actividades: aquellas que implican manipulaciones realizadas en el laboratorio de biología por un lado; y aquellas que requieren análisis y producción bibliográfica por otro. A) Actividades de laboratorio: Trabajo Práctico de laboratorio N0 1: Instrumentación biológica 1- Describa en detalle el equipamiento utilizado para la electroforesis de ácidos nucleicos 2- Describa en detalle el equipamiento utilizado para la electroforesis de proteínas 3- a) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 50 µl? b) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 2 µl? c) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 0,4 µl? d) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 300 µl? 4- a) Qué velocidad máxima alcanza una microcentrífuga estándar? b) Nombre los casos en los que se necesita utilizar una centrífuga refrigerada 5- Cómo se procede para crecer cultivos bacterianos en medio líquido? 6- Describa el equipo utilizado para realizar las reacciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) 7- Qué es un lector ELISA? Describa las partes del equipo, y sus aplicaciones 8- Cómo se procede para criopreservar células? 9- Indique en cada caso qué sistema de microscopía Ud. utilizaría para las siguientes aplicaciones: a) Observación de una monocapa de células de riñón de embrión de mono 29
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR para evaluar la densidad y morfología del cultivo b) Determinación de la estructura de las mitocondrias presentes en tejido de miocardio c) Visualización de la morfología del ojo de un insecto d) Observación del proceso de brotación del virus de leucemia murina a través de la membrana plasmática de un linfocito infectado e) Visualización del resultado de una tinción de Gram de bacterias f) Localización subcelular de una proteína g) Analizar si una proteína está localizada en mitocondrias o es citoplasmática 10- Describa la estrategia que utilizaría para separar una población de linfocitos T CD4+ de una CD8+ Trabajo Práctico de laboratorio N0 2: Separación de fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa. 1. Objetivos Familiarizarse con las técnicas de separación de macromoléculas por electroforesis Separar por electroforesis en gel de agarosa ADN plasmídico así como fragmentos de ADN generados por digestión con enzimas de restricción Calcular la masa molecular de moléculas de ADN incógnita a partir de una curva de calibración construida utilizando fragmentos de ADN de tamaño conocido 2. Desarrollo experimental a) Preparar un gel de agarosa en buffer TBE. Tener en cuenta que el porcentaje de agarosa del gel deberá permitir la separación de fragmentos de ADN de tamaño comprendido entre 25 kb y 300 bp, así como el análisis de preparaciones de ADN plasmídico b) Agregar a cada muestra de ADN el buffer de muestra 6X 30
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR c) Resolver las muestras de ADN por electroforesis hasta que el colorante azul de bromofenol haya migrado aproximadamente ¾ partes del gel d) Teñir el gel con bromuro de etidio (solución 0.5 µg/ml) durante 5 minutos e) Visualizar las bandas de ADN por transiluminación del gel con luz u.v. f) En base a los datos provistos para los fragmentos de la muestra de ADN del fago λ digerido por HindIII, construir la curva de calibración correspondiente y calcular la masa molecular de los fragmentos de ADN incógnita Composición de las soluciones utilizadas: Buffer 10X TBE: Por litro de solución: 121.1 g Tris base; 55 g ácido bórico; 7.4 g de Na2EDTA. (1 M Tris-borato [pH 8.3], 20 mM EDTA) 6X buffer muestra: 0.25 % de azul de bromofenol; 0.25 % xylene cyanol FF; 0.4 % colorante orange G; 30 % glicerol; 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) y 50 mM EDTA. Este buffer permite sembrar las muestras en los pocillos del gel de agarosa y monitorear la migración durante la electroforesis. En un gel de agarosa 0.5-1.4 % en buffer 1X TBE, el xylene cyanol FF migra aproximadamente como una molécula de DNA de 4 kb, el azul de bromofenol como una molécula de aproximadamente 300 bp, y el orange G como una molécula de aproximadamente 50 bp. 3. Curva de calibración y determinación del PM de los fragmentos de ADN incógnitas Tamaño del Distancia de Distancia de Tamaño calculado fragmento de migración del migración del para el ADN ADN patrón ADN patrón ADN incógnita incógnita (pb) (pb) (cm) (cm) 31
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Trabajo Práctico de laboratorio N0 3: Análisis de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) OBJETIVOS Comprender el principio de resolución y separación de polipéptidos por medio de la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida Realizar un análisis comparativo, por medio de la metodología de SDS- PAGE, de muestras de lisados de bacterias que producen una proteína recombinante PARTE PRACTICA Análisis por electroforesis de muestras de lisados provenientes de bacterias Escherichia coli que expresan diferentes proteínas recombinantes A. Preparación del gel de poliacrilamida 1- Preparar la solución de acrilamida del gel separador. El porcentaje de acrilamida a utilizar dependerá del tamaño de proteínas a separar 2- Cargar el gel con la solución de acrilamida de gel separador + APS + TEMED, y agregar una delgada capa de butanol 3- Una vez que haya gelificado la parte inferior del gel, lavar exhaustivamente con agua. Secar con papel de filtro la superficie del gel y agregar la solución de gel "stacking". Colocar el peine evitando que queden burbujas en las calles donde se van a sembrar las muestras B. Siembra del gel de poliacrilamida 1- Una vez que se haya preparado la cuba de electroforesis y llenado de buffer de corrida, sembrar las muestras de acuerdo a lo discutido en clase 2- Realizar la migración electroforética a V=cte.=100 volts, hasta que el colorante azul de bromofenol haya llegado al borde inferior del gel. 32
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR C. Visualización de las proteínas analizadas en el gel de poliacrilamida 1- Una vez separado el gel de las placas de vidrio, lavar 3 veces (5 min cada vez) con H2O, y luego teñirlo en solución de Coomassie Blue coloidal durante 60 min. 2- Desteñir el gel en solución de H2O SOLUCIONES - Solución 10X BUFFER DE ELECTROFORESIS: 250 mM Tris base; 2.5 M glicina; 1% SDS (pH 8.3) - Solución 4X LOWER (para gel separador): 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) - Solución 4X UPPER (para gel stacking): 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) - Solución 10 % (NH4)2S2O8 - Buffer de siembra Laemmli: 62 mM Tris-HCl (pH 6.8); 2% SDS; 50 mM DTT; 10 % glicerol; 0.01% azul de bromofenol - Solución 30 % acrilamida-bisacrilamida (29.2: 0.8) DATOS ADICIONALES Marcadores de peso molecular a utilizar: Low Range Unstained Protein Marker (marca BIORAD): Fosforilasa b (97,4 kDa); seroalbúmina bovina (62,2 kDa); ovoalbúmina (45 kDa); anhidrasa carbónica (31 kDa); inhibidor de tripsina (21,5 kDa); lisozima (14,4 kDa) Trabajo Práctico de laboratorio N0 4: Cultivo y propagación de células in vitro OBJETIVOS Comprender los fundamentos del cultivo de células de mamífero in vitro Familiarizarse con las técnicas de cultivo y propagación de células Determinar, de manera experimental, los requerimientos para el crecimiento y división celular in vitro 33
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR PARTE PRÁCTICA PARTE A: Plaqueo de células en medios de cultivo de diferente composición 1- Disgregación del cultivo de células COS-7L: luego de eliminar el medio de cultivo, lavar la monocapa de células con 1 ml de solución de tripsina- EDTA, e incubar las células a 37 °C en 1 ml de la solución de tripsina hasta que éstas se desprendan de la superficie plástica. 2- Retirar las placas de la estufa, y aspirar repetidamente la suspensión de células con una pipeta de manera de lograr la disgregación completa del cultivo de células. 3- Determinar el número total de células de ese cultivo contando en una cámara de Neubauer 4- Plaquear, en base a lo discutido en clase, la cantidad de células necesaria para que el cultivo alcance la confluencia en 24 horas. CADA ALUMNO PLAQUEARÁ EN UN MEDIO DE CULTIVO DE COMPOSICIÓN DIFERENTE. 5- Incubar las células a 37 °C y 5% CO2 durante 24 horas. PARTE B: Evaluación del crecimiento y proliferación de las células COS-7L crecidas en medios de cultivo de diferente composición 4- Observar al microscopio invertido los cultivos de células COS-7L y evaluar si las células: (i) se han adherido a la superficie plástica de la placa; (ii) se han dividido y crecido; (iii) conservan la morfología del cultivo inicial 5- En base a las observaciones y resultados obtenidos, enumerar sus conclusiones respecto de la capacidad de los medios de cultivo utilizados de estimular el crecimiento y proliferación celulares. 34
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR COMPOSICIÓN DE MEDIOS Y BUFFERS - Buffer de disociación Tripsina-EDTA: 0,5 g/l de tripsina; 0,2 g/l de EDTA en solución buffer de sales de Hanks; contiene rojo fenol. - Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): sales inorgánicas (0,2 g/l CaCl2; 0,0001 g/l nitrato férrico.6H2O; 0,097 g/l MgSO4; 0,4 g/l KCl; 3,7 g/l NaHCO3; 0,4 g/l NaCl; 0,109 g/l NaH2PO4); L-aminoácidos; vitaminas (0,004 g/l cloruro de colina; 0,004 g/l ácido fólico; 0,0072 g/l mio-inositol; 0,004 g/l niacinamida; 0,004 g/l piridoxina.HCl; 0,0004 g/l riboflavina; 0,004 g/l tiamina.HCl; 0,004 g/l ácido D-pantoténico [hemicalcio]); 4,5 g/l D-glucosa; 0,11 g/l ácido pirúvico; 0,0159 g/l rojo fenol.Na. SUPLEMENTAR CON: 0,584 g/l L-glutamina 35
GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR B) Actividades de análisis y producción bibliográfica: Trabajo Práctico bibliográfico N0 1: Elaboración de una monografía Objetivo: Entrenar al alumno en la búsqueda, organización y comprensión de información referente a la biología celular Reglas de presentación: 1) Cada alumno debe elegir un tema pertinente a la asignatura (preferentemente los tópicos trabajados en la primera parte de la misma) y ponerlo a consideración de la docente. Algunos de los temas sugeridos son los siguientes: Funciones de los proteoglucanos en la MEC Dominios especializados de la membrana plasmática (caveolas, lipid- rafts) Papel de receptores y clatrina en la endocitosis mediada por receptor Participación de selectinas e integrinas en la extravasación de leucocitos durante la respuesta inflamatoria Funciones del citoesqueleto de actina en adhesión intercelular y anclaje a la MEC Participación de microtúbulos en el transporte de vesículas y organelas Participación de filamentos intermedios en uniones de anclaje 2) El alumno deberá recopilar trabajos científicos referentes al tema elegido (de los sitios cuyos links figuran en la lista adjunta). Preferentemente los trabajos deben ser revisiones completas y no menos de tres (3). Si se trata de resúmenes de trabajos deben incluirse al menos seis (6). Las copias de los trabajos analizados deben presentarse como anexo de la monografía en forma completa. Pueden incluirse en la bibliografía libros y sitios de Internet pero ello NO REEMPLAZA el análisis de trabajos científicamente reconocidos. 3) Una vez conseguido el material para trabajar, el alumno podrá reformular el alcance de la monografía (Por ejemplo, si elige el tema "Funciones de los proteoglucanos en la MEC" pero empleará sólo trabajos acerca de las 36
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