Extracción y Cuantificación de ADN
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Extracción y Cuantificación
de ADN
Tecnología Básica
9Extracción y Cuantificación
9Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction)
9Separación: Electroforesis
9Detección
9Análisis
Extracción de ADN: Múltiples maneras!!
1
EXTRACCION DE ADN
ORGANICA
CHELEX
PAPEL FTA
OTRAS
Extracciones basadas en estuches
QIAamp, GeneClean, etc.
Pueden depender en
Protocolos de LAB
Tipo de muestra
Preparación de Muestra
Extracción de ADN Orgánica
Extracción por Chelex
Extracción de ADN utilizando papel
FTA
Estuches QIAamp para separar ADN
Equipo basados en robótica pueden
requerir otros métodos
EXTRACCION ORGANICA DE ADN
PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL
ALCOHOL (PCI)
PRODUCE ADN DE ALTO PESO
MOLECULAR
CONSUME MUCHO TIEMPO
QUIMICOS PELIGROSOS
MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles
errores)
2EXTRACCION ORGANICA DE
ADN
COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO
AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K
ROMPE LAS CELULAS (SDS)
ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y
lípidos
Particiona macromoléculas basedo en propiedades
hidrofóbicas e hidrofílicas
Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol
Alcohol Isoamyl disminuye la espuma
ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
RECUPERACION DE ADN
Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto
EXTRACCION POR CHELEX
1991 Laboratorios Bio-Rad
RESINA QUELANTE
REMUEVE MAGNESIO
(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA
CELULA
UTILIZE SOLO CON PCR (cadena
sencilla)
EXTRACCION POR CHELEX
AÑADA MUESTRA AL TUBO
AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE
CHELEX
100°C PARA ROMPER CELULAS
DESTRUIR PROTEINAS
ADN ES DENATURADO A CADENAS
SENCILLAS
UTILIZE SOBRENADANTE
DIRECTAMENTE EN PCR
3EXTRACCION CON PAPEL
FTA™
PAPEL ALMACENAJE A BASE DE
CELULOSA
CONTIENE QUIMICOS
PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E
INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS
UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O
SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
Tecnología FTA®
Rompe células y membranas de
organelos
-Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos
(ADN & ARN)
Preserva y Proteje Acidos
Nucleicos
-Previene Daño por radicales libres/UV
-Previene Daño Enzimático
-Inhibe crecimiento de hongos y
bacterias
Provee Seguridad al Usuario
-Inactiva Potenciales Viruses
Peligrosos
Preparación de ADN Rápida y Eficiente
4FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva
Convencional versus FTA
240 Tarjetas = 240 muestras
Temp de almacenaje = Temp
ambiente
240 Tubos = 240 muestras*
Temp de almacenaje= -200C
10 Platos = 240 muestras
Temp de almacenaje = -200C
Costo Costo
$2,000/congelador/año $75/gabinete de
archivo
Archivado a Temperatura Ambiente
Perfil de STR de 100 120 140
6 Blue
160 180
Blood-B-Pro
200 220 240 260 280 300 320 340 360
4000
sangre archivada en 3000
2000
1000
1989 y analizada en
2003 6 Green Blood-B-Pro
1500
1000
500
• Muestras archivadas en
ambientes diferentes,
selladas en sobre de 6 Yellow Blood-B-Pro
2000
aluminio 1500
1000
500
• Proceso normal de
colección de muestra
6 Red Blood-B-Pro
• 10 µL de reacciones de 600
400
Profiler™ añadido a 200
muestras, 24 ciclos
EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
Sangre o saliva seca en papel FTA
Células se ROMPEN al contacto
UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al
TUBO
LAVE para remover HEME y otros
inhibidores de PCR
Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción
de PCR
5EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
CUANTIFICACIÓN NO es necesaria
Cantidad de muestra consistente
Resultados consistentes
Posible AUTOMATIZACIÓN
ORGÁNICA CHELEX Papel FTA
SDS, DTT, EDTA Aplicar sangre al
Mancha y papel y dejar que
de proteinase K Mancha se seque
sangre de Agua
sangre
ENCUBAR (56 oC)
ROTO
Centrifugar
ENCUBAR (ambiente)
Phenol,
chloroform, Centrifugar
isoamyl alcohol
REMOVER sobrenadante
VORTEX 5% LAVAR Múltiples veces
Centrifugar Chelex con buffer de extracción
TRANSFER aqueous (upper) phase REMOVER sobrenadante
to new tube
ENCUBAR (56 oC) Reactivos
TE buffer de PCR
ENCUBAR (100 oC)
Centrifugar
CONCENTRAR muestra
(Centricon/Microcon-100 or ethanol (NO CUANTIFICACIÓN)
precipitation)
CUANTIFICAR
Centrifugar ADN
PREPARAR PCR
CUANTIFICAR PREPARAR PCR
ADN
PREPARAR PCR
Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
CUANTIFICACIÓN DE ADN
ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR
MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE
ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS
DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA
MÉTODOS INICIALES NO MUY
SENSITIVOS O ESPECÍFICOS
ABSORBENCIA A 260 nm
TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
Cuantificación comparada a marcador estándar
6Cuantificación por "Slot Blot"
Procedimiento Común
Específico para primates
Ha sido modificado para utilizar
quimioluminiscencia en vez de radioactivida
Puede detectar cantidades menores que
nanogramos
Puede detectar ADN de cadena doble y
cadena sencilla
CUANTIFICACIÓN DE ADN
CUANTIFICACIÓN POR "SLOT
BLOT"
ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE
PRIMATE
D17Z1
RADIOACTIVO
COLORIMÉTRICO
QUIMIOLUMINISCENTE
CUANTIFICACIÓN DE ADN
CAPTURAR ADN GENÓMICO EN
MEMBRANA DE NILÓN
AÑADIR PRUEBA D17Z1
INTENSIDAD DE LA MUESTRA
COMPARADA A ESTÁNDARES
SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50
copias de ADN genómico
7Slot Blot
Ventajas Desventajas
Puede ser sensitivo Consume tiempo
Reemplaza Labor intensiva
radioactividad
Puede detectar
cadenas sencillas y
ADN parcialmente
degradado.
Cantidad dada es
sólo de ADN
humano
Muestras
Estándares de Desconocidas Estándares de
Calibración Calibración
20 ng ~2.5 ng 0.63 ng
10 ng 1.25 ng
2.5 ng
5 ng
5 ng
2.5 ng
10 ng
1.25 ng
20 ng
0.63 ng
Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Fluorometría vs
Espectrofotometría
8Fluorometría
*Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o
PicoGreen
-- aumento en emisión a 458 nm cuando
enlazado a ADN de doble cadena
*Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla
o ARN
--se enlaza al surco menor, rico en A-T
*Muestra es comparada a curva estándar de ADN
cuya concentración es conocida
--utilize estándar con composición similar
para lecturas más precisas
Cuantificación de ADN por
espectrofotometría
Concentración de ADN puede ser determinada
midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un
espectrofotómetro utilizando una cubeta de
cuarzo
Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.
Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a
50 µg de ADN por ml
A260 = 1 50 µg/ml
Pureza de ADN: Proporción A260/A280
*Proporción indica pureza/presencia de
contaminantes que pueden absorber luz UV
(proteínas, etc.)
*ADN puro tiene una proporción de 1.7-2.0
--en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5
*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN)
--imita alta pureza y producción
--aumenta el valor A260
9PCR utilizando 'Real
time'
(qPCR)
Continuará!!
10También puede leer
