Diagnóstico Virológico PCR y pruebas rápidas: Gripe A - Carlos Artaza Alvarez MIR 4 Hospital Universitario Fundación Alcorcón

Diagnóstico Virológico PCR y
pruebas rápidas: Gripe A.

             Carlos Artaza Alvarez
           MIR 4 Hospital Universitario
              Fundación Alcorcón

Reacción en Cadena de la
            Polimerasa
              (RCP)
INTRODUCCION:
 Década de los 70: Grandes avances en
  Biología Molecular:
     •   Enzimas de restricción
     •   Clonación de genes en plásmidos y fagos
     •   Técnicas de hibridación en filtro para ADN y ARN
     •   Técnicas de secuenciación química y enzimática
         ADN

INTRODUCCION

 1983: Kary Mullis desarrollo una nueva
  técnica que hizo posible la síntesis de
  grandes cantidades de un fragmento de
  ADN sin necesidad de clonarlo: PCR
  (polymerase chain reaction).
 Consiguió copiar millones de veces, en un
  par de horas, una secuencia predeterminada
  dentro de una mezcla de ADN.

PCR: Definición

    Síntesis "in vitro" de secuencias específicas de
     ADN.
    La técnica se basa en la repetición de ciclos de
     síntesis de DNA dirigida por oligonucleótidos
     para realizar la replicación en forma
     exponencial de secuencias diana de ácidos
     nucleicos (Amplificación del DNA).

AMPLIFICACION EXPONENCIAL DNA

PCR: Definición

 Es una técnica:
     Altamente especifica
     Muy sensible: en principio, para practicarla
      bastaría una sola molécula (genoma humano)
       ~6 picogramos.
     Robusta, utiliza como sustrato al ADN de
      muestras sin necesidad de ser purificada de su
      fuente natural (tejidos embebidos en parafina,
      lavados bronquiales, exudados de mucosas, etc)

PCR: Componentes de la
Reacción
 1.   Enzima (DNA polimerasa):
 -    Capaces de sintetizar DNA o RNA “in
      Vitro”.
 -    Requieren un molde y sintetizan una molécula
      complementaria al molde.
 -    Capaces de actuar a altas temperaturas
      empleadas en la reacción.
 -    Inicialmente: DNA polimerasa de E. Coli 
      inestabilidad térmica (necesario agregar en
      cada ciclo)

PCR: Componentes de la
Reacción
    Actualmente Enzimas termoestables: Taq
     (Thermus acuaticus) y la Vent (Thermococcus
     litoralis)  °T optimas: 72°C.
    Taq:
      • Proteína de una sola cadena polipeptídica.
      • Peso molecular de 95 kDa.
      • Fidelidad de replicación depende de la [Mg+2] y de
        los dNTPs y del balance de estos.
      • Tasa de incorporación de nucleótidos: 150
        nucleótidos /seg.

PCR: Componentes de la
Reacción
 2. DNA molde:
 - La concentración de DNA molde depende de la
   fuente utilizada.
 - Idealmente: 20 nanogramos a 1 microgramo de
   DNA genómico de células eucariotas.
 - No es necesario purificar el DNA molde.
 - Eliminar los inhibidores de la polimerasa.
 - Para muestras clínicas: extracción con fenol-
   cloroformo y posterior precipitación de Ácidos
   nucleicos con etanol o isopropanol.

PCR: Componentes de la
Reacción
 3. Cebadores o iniciadores (Primers):
   -Oligonucleótidos sintéticos
   -Componente mas sensible que determina el éxito de
     la PCR.
   -Se deben seleccionar dos iniciadores que estén
     localizados en los extremos de la región de interés.
   - Longitud: 18 a 30 nucleótidos (↓  < especificidad).
   - Contenido: G+C entre 40-75%.
   - Concentración: 0.1 a 0,5 uM.
   - Deben carecer de estructura secundaria.

PCR: Componentes de la
Reacción
   - No deben ser complementarios entre si.
   - Existen programas informáticos para el diseño de
     cebadores.
   - El extremo 3’ del nucleótido iniciador se fija a un
     soporte sólido (gel de sílice) y un sintetizador de
     DNA añade paso a paso cada nucleótido en una
     serie de etapas.

“Maquina de genes”: Construye cadenas de
oligonucleótidos utilizados durante la PCR.
(Oligo 1000M DNA Synthesizer)

PCR: Componentes de la
Reacción
 4. Dexosirribonucleósidos trifosfatados
   (dNTPs):
    - Son los ladrillos con los que se construye las nuevas
      cadenas de DNA.
    - Cuatro: dATP, dTTP, dCTP y dGTP.
    - Concentración equimolar de los 4 dNTPs
    - Concentración óptima: 20 y 200 uM.
    - Bajas concentraciones: < índice de incorporación.
    - Altas concentraciónes: < especificidad

PCR: Componentes de la
Reacción
 5. Otros componentes:
   - Solución amortiguadora:
      • Incluye: HCl, KCl, gelatina y MgCl2.
      • Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe.
   - Agua:
      •   Solvente del resto de componentes
      •   Al menos destilada, purificada por UV y ozono
      •   Libre de DNAsas y RNAsas
      •   Desionizada
   - Magnesio: Función critica:

 Los iones de magnesio
  estimulan a la enzima Taq
  Polimerasa para que
  incorpore los dNTPs.
      • Bajas concentraciones:
        Bajo rendimiento
      • Exceso Mg:
        amplificaciones
        inespecificas

RCP: Etapas.

 1. Desnaturalización DNA

   –   Incubación DNA molde (92-98ºC, de 30-90 seg)
   –   Separación de cadenas complementarias por
       ruptura de los puentes de hidrógeno.
   –   Cadenas DNA blanco accesibles al apareamiento.
   –   Etapa crítica, importante DNA molde se
       desnaturalice completamente

Desnaturalización del DNA

°T: 92-98°C

      30-90 seg

RCP: Etapas.

 2. Alineamiento

   –   Enfriamiento de la reacción
   –   Hibridación de cadenas desnaturalizadas con
       cebadores o iniciadores (Primer: DNA sintético de
       hebras sencilla)
   –   Temperatura optima (°T de fusión) depende de
       los cebadores (generalmente 50 a 60 °C)

Alineamiento

ºT: 50-60ºC

RCP: Etapas.

 3. Reacción de extensión:

   –   Se efectúa a una temperatura intermedia: 72°C
   –   Actúa la DNA polimerasa extendiendo la longitud
       de los cebadores.
   –   Incorpora los nucleótidos libres en dirección 5’ 
       3’ complementando la cadena que actúa como
       molde.

Reacción de extensión

°T: 72 °C

RCP: Etapas.
    Estas tres etapas constituyen un ciclo térmico y se
     realizan en forma automatizada en un
     TERMOCICLADOR

RCP: Etapas.

    Protocolo típico  30 a 50 ciclos
    Al completar ciclo  Fragmentos recientes
     sirven de molde.
    En pocos ciclos  Fragmento sintetizado
     producto predominante (amplificación).
    Longitud del fragmento DNA distancia entre
     los cebadores.

RCP: Etapas.

    Evitar un número alto de ciclos : dan lugar a la
     amplificación de productos originados por
     hibridaciones inespecíficas.
    La enzima sufre el efecto meseta: exponencial
      Aritmética  estacionaria.
    Cuando el efecto meseta se presenta la cantidad
     de DNA sintetizada es suficiente para su
     utilización.

Tasa de producción de DNA por PCR

Contaminación en PCR:

    La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una
     técnica muy sensible, por lo que es de gran
     importancia evitar contaminaciones
    Existen una serie de normas que ayudan a evitar
     las contaminaciones:
      •   Lugar físico exclusivo para realizar la PCR
      •   Uso de instrumental exclusivo para la PCR
      •   Utilización de reactivos y tubos estériles
      •   Uso de guantes
      •   Controles blanco

Análisis del producto de una
RCP:
     Después de la amplificación:

       • DNA puede colocarse en gel de agarosa
       • Realizar el corrimiento electroforético,
       • Teñirlo y observar en luz ultravioleta el producto de
         la RCP.

Análisis del producto de una
RCP:
     El análisis mas fino y la caracterización 
      metodologías adecuadas:

       • Análisis electroforético en geles poliacrilamida.
       • Digestiones con enzimas de restricciones
       • Hibridación con detectores específicos (genes
         clonados)
       • Secuenciación nucleotídica.

PCR:DESVENTAJAS
 La PCR supuso un gran avance y permitió
  introducir la biología molecular de forma
  generalizada en los laboratorios asistenciales.

 El hecho que complica y alarga
  extraordinariamente el proceso es la visualización
  del producto una vez amplificado, que debe
  hacerse por hibridación en solución o en fase
  sólida (southern blot).

PCR:DESVENTAJAS

 De esta manera se tarda entre 2 a 4 días en
  poder informar un resultado.
 Se necesita disponer de personal altamente
  especializado.
 Espacio suficiente para poder separar varias
  áreas de trabajo con la finalidad de evitar la
  temible contaminación por ADN sintetizado
  con anterioridad.

PCR A TIEMPO REAL
           (PCR-RT)
 La mayoría de los inconvenientes se han
  solucionado con la introducción de la PCR
  realizada en tiempo real (PCR-RT).
 Elimina cualquier proceso post-PCR puesto
  que monitoriza la progresión de la
  amplificación en el momento en que ocurre.

PCR A TIEMPO REAL
           (PCR-RT)
 A diferencia de la PCR convencional que
  mide la acumulación ADN al final de un
  número predeterminado de ciclos, con PCR-
  RT esto se hace durante el proceso de
  amplificación usando fluorescencia.
 El aumento de la fluorescencia es
  proporcional a la cantidad de ADN
  formada.

PCR A TIEMPO REAL
           (PCR-RT)
 El proceso se puede automatizar fácilmente
  usando un sistema que realice la
  amplificación (termociclador) y que a su
  vez sea capaz de leer fluorescencia.
 Dado que la amplificación y la detección
  ocurren al mismo tiempo, el análisis es más
  rápido que en la PCR en punto final.

PCR A TIEMPO REAL
             (PCR-RT)
 La incorporación de fluorescencia al
  proceso de PCR se puede hacer de muy
  diversas maneras, pero las más utilizadas
  son:

     Colorantes intercalados
     Sondas marcadas.

PCR A TIEMPO REAL
           (PCR-RT)
 Las sondas marcadas: son secuencias de
  oligonucleótidos que reaccionan por
  complementariedad de bases con un
  pequeño fragmento de la secuencia a
  amplificar.
 Estas sondas están marcadas con moléculas
  que emiten fluorescencia (fluoróforos)
  cuando se produce la amplificación
  específica.

PCR A TIEMPO REAL
           (PCR-RT)
 Las sondas se colocan en la reacción de
  PCR junto con los otros reactivos y
  solamente se detecta fluorescencia, si la
  secuencia de interés está presente en la
  muestra y hay amplificación.

PCR A TIEMPO REAL
             (PCR-RT)
 Las sondas fluorescentes más usadas son de
  tres tipos:
     sondas con actividad 5’ nucleasa (TaqMan)
     molecular beacons y
     Sondas FRET.
 Las tres se pueden aplicar en microbiología
  clínica, aunque las sondas FRET son las
  más complejas.

Sondas Taqman

PCR A TIEMPO REAL
             (PCR-RT)
 Agentes intercalantes de ADN: otro
  formato ampliamente utilizado.
 El mas empleado es el SYBR Green.
     El SYBR Green no emite fluorescencia cuando
      se encuentra en solución.
     En presencia de ADN doble cadena, el SYBR
      Green se intercala entre las cadenas de ADN
      emitiendo así una señal fluorescente.

PCR A TIEMPO REAL
           (PCR-RT)
   Este fluorocromo se agrega a la reacción de
    PCR junto con los otros reactivos.
   Si en la reacción de PCR hay amplificación, el
    SYBR Green se une al ADN de doble cadena
    recién sintetizado en cada ciclo y va generando
    un aumento en la señal de fluorescencia que es
    proporcional a la cantidad de producto
    generado durante la amplificación.

Aplicaciones de la PCR a tiempo real
     en la microbiología clínica
  No difieren de las de la PCR convencional.
   1 . Diagnóstico etiológico.
   2 . Control del tratamiento con antimicrobianos.
   3 . Caracterización genética de agentes
     infecciosos. Genotipificación; identificación de
     mutaciones determinantes de resistencias a
     fármacos o de virulencia; epidemiología
     molecular

Aplicaciones de la PCR a tiempo real
     en la microbiología clínica
  No obstante, gracias a sus indudables
   ventajas y a la sencillez de su empleo, la
   PCR a tiempo real ha ido reemplazando la
   PCR clásica
  Su aplicación se extiende a un número cada
   vez mayor de agentes infecciosos,
   implementándose progresivamente en la
   rutina asistencial.

PCR:DIAGNOSTICO DE LA
         GRIPE A
 El virus de la gripe A(H1N1) deriva de
  diferentes linajes que han circulado en
  cerdos en el último tercio del siglo XX.
 Se trataría de un ejemplo más del papel que
  se sabe que desempeña este mamífero como
  mediador en el reagrupamiento genético del
  virus de la gripe A que posteriormente
  acaba afectando a humanos.

PCR:DIAGNOSTICO DE LA
         GRIPE A
 El análisis filogenético de los diferentes
  fragmentos genómicos del virus A(H1N1)
  muestra un cuádruple origen.
 En una fase final parece haberse producido
  una modificación del virus porcino AH1N1
  (linaje clásico porcino norteamericano,
  linaje aviar norteamericano y linaje
  humanoH3N2).

Obtención, conservación y
        transporte de las muestras
 1. Tipos de muestras:
     Con mejor rendimiento diagnóstico:
       • frotis de nasofaringe
       • lavado o aspirado nasofaríngeo
     Menor rendimiento diagnóstico
       • frotis nasal
       • frotis faríngeo
     Muestras inadecuadas
       • moco
       • saliva

Obtención, conservación y
      transporte de las muestras
 2. Conservación y transporte
     Períodos no superiores a 48-72 horas:
      refrigeradas a 4º C. El transporte también será
      refrigerado (acumuladores de frío).
     Períodos superiores: congeladas,
      preferiblemente a -70º C. Se recomienda
      mantener la congelación durante el transporte.

Obtención, conservación y
      transporte de las muestras
 3. Condiciones de bioseguridad
     Para el transporte y la manipulación de las
      muestras, se deben seguir las recomendaciones
      específicas de un nivel de bioseguridad 2.

PCR-TR : GRIPE A
 Componente del virus que detecta:
     Ácidos nucleicos, utiliza cebadores y sondas
      específicos para detectar un fragmento del gen de la
      hemaglutinina y de la proteína M2 de A(H1N1)v.
 Tipo de ensayo:
     PCR a tiempo real.
 Tiempo de realización:
     3-4 horas.

Amplificación de un RNA mediante transcripción inversa del RNA a
   cDNA y posterior PCR con la DNA polimerasa de Thermus
                        thermophilus.

PCR-TR : GRIPE A
 Sensibilidad de la prueba:
     No está suficientemente evaluada, y depende de
      varios factores:
       a) Del sistema de extracción del material genético del
          virus a partir de la muestra
       b) de la propia técnica: no todas las técnicas de PCR son
          equivalentes
       c) de la experiencia de cada laboratorio.
       d) de la muestra a evaluar: tipo de paciente, situación
          epidémica, etc.

PCR-TR : GRIPE A

 Especificidad de la prueba:
     Igualmente, no está evaluada adecuadamente.
     Depende del tipo de muestra y de la experiencia
      de cada laboratorio.
     En la actual situación epidémica, y en un
      laboratorio de Microbiología experimentado,
      puede asumirse que supera el 98%.

PCR-TR : GRIPE A

 Ventajas:
  a)   Sensible y específica.
  b)   Rápida, aunque esta dependerá:
       a)Disponibilidad de equipos humanos organizados y
         bien entrenados, y
       b)Volumen de muestras a procesar.
  c)   Algunas variantes técnicas permitirían la
       cuantificación de la carga vírica.

PCR-TR : GRIPE A

 Inconvenientes:
  a)   Requiere equipamiento específico.
  b)   Requiere de la existencia y disponibilidad de
       microbiólogos bien entrenados.
  c)   Detecta genoma viral, pero no informa si
       exista viabilidad del virus, por lo que no se
       recomienda para monitorizar tratamientos, ni
       evaluar la respuesta clínica.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
   VIRUS RESPIRATORIOS
  Detección de antígenos virales:
      Permite una rápida obtención de resultados,
       generalmente en unas pocas horas después de la
       recepción de la muestra.
      Resultados a menudo son difíciles de
       interpretar.
      La especificidad dependerá de la experiencia
       del personal que los realice.
      La sensibilidad suele ser baja.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
   VIRUS RESPIRATORIOS
     Métodos utilizados para la detección de los
      antígenos virales directamente en la muestra
      clínica:
       • Inmunofluorescencia
       • enzimoinmunoanálisis (EIA)
     Antígenos virales utilizados: moléculas que se
      sitúan en la superficie del virus,
       • la hemaglutinina y
       • la neuraminidasa,

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
   VIRUS RESPIRATORIOS
     También pueden encontrarse en la superficie de
      las células infectadas.
     Es posible emplear otras proteínas menos
      accesibles del virus como las nucleoproteínas,
      que son menos variables.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
   VIRUS RESPIRATORIOS
  Se han comercializado técnicas:
      Inmuno-cromatografía capilar y
      Enzimoinmunoanálisis de membrana
  Posibilitan detectar virus gripales o sus
   antígenos en pocos minutos y su lectura es
   visual.

PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
   VIRUS RESPIRATORIOS
  Amplia implantación en la asistencia
   urgente y en el ámbito pediátrico
  No obstante, su utilidad se ve limitada
   debido a su coste y bajas sensibilidad y
   especificidad.

Diferentes Pruebas de detección rápida de
antígenos disponibles para virus gripales

GRACIAS