Rol del microbioma intestinal en el mecanismo de la remisión temprana de la diabetes mellitus tipo 2 inducida por los procedimientos bariátricos
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Universidad ORT Uruguay
Facultad de Ingeniería
Rol del microbioma intestinal en el mecanismo de la
remisión temprana de la diabetes mellitus tipo 2
inducida por los procedimientos bariátricos
Entregado como requisito para la obtención del título de Ingeniería en Biotecnología
Fernando Slamovitz – 213254
Tutor: MD. PhD. Avner Leshem
2021
Declaración de autoría
Yo, Fernando Slamovitz, declaro que el trabajo que se presenta en esta obra es de mi propia mano.
Puedo asegurar que:
La obra fue producida en su totalidad mientras realizaba una pasantía (en calidad de Visiting
Reserarcher) en el laboratorio de Dr. Eran Elinav en el Weizmann Institute of Science con
propósito de mi trabajo final de carrera;
Cuando he consultado el trabajo publicado por otros, lo he atribuido con claridad;
Cuando he citado obras de otros, he indicado las fuentes. Con excepción de estas citas, la
obra es enteramente nuestra;
En la obra, he acusado recibo de las ayudas recibidas;
Cuando la obra se basa en trabajo realizado conjuntamente con otros, he explicado
claramente qué fue contribuido por otros, y qué fue contribuido por mí;
Ninguna parte de este trabajo ha sido publicada previamente a su entrega, excepto donde
se han realizado las aclaraciones correspondientes.
Firma:
Aclaración: Fernando Slamovitz
Fecha: 16/06/2021
2
Dedicatoria
A mis padres por el extraordinario esfuerzo realizado para brindarnos lo mejor a mi hermano y a mí.
A mi hermano mayor Diego por ser mi guía.
3
Agradecimientos
Al Dr. Eran Elinav, por recibirme en su laboratorio.
Al Dr. Avner Leshem por enseñarme todo y convertirse en un gran amigo: Toda raba, Jefe!!!
Al Weizmann Institute of Science de Israel, por recibirme en su campus.
A todos los miembros del laboratorio Elinav por enseñarme y ayudarme en todos los
aspectos de mi trabajo durante este año.
o Leviel, Denise, Rafa, Noa, Niv, Kim, Sara, Lara, Karina, Hodaya
o Yotam, Uria, Sam, Danping, Ola, Lorenz, Melina, Gayatree, Suhaib, Timur
o Mally y Hagit
A los correctores de la tesis:
o Dr. Gregorio Iraola, referente del estudio de microbiomas en el país, por su
generosidad para corregir mi tesis y recibirme en su laboratorio para realizar una
pasantía antes de irme a Israel compartiendo su sabiduría sobre el tema para
prepararme de la mejor manera para el laboratorio Elinav. También por su atención
para responder mis dudas y consultas sobre el tema de manera constante y
dedicada.
o Dr. Marcelo Viola, cirujano referente del país, por su generosidad para corregir mi
tesis y enseñarme acerca de los pacientes de procedimientos bariátricos. También
por su generoso apoyo científico e increíble disponibilidad para responder dudas y
consultas sobre el tema de manera constante y dedicada.
A mis amigos LDS, los del maca y los del ELF por siempre estar y hacer que todo sea más fácil
y divertido.
A Florencia
A la familia y amigos de Israel por estar siempre
Al resto de mi familia: primos, tíos, abuelos.
Al gran Mr. G por, entre otras cosas, acompañarme durante el proceso de aplicación al
laboratorio.
A mis compañeros de carrera
A profesores de ORT por la tremenda dedicación durante estos 5 años en los que aprendí
mucho y me formé como ingeniero en biotecnología.
4
Resumen
Actualmente 422 millones de adultos padecen Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) a nivel mundial,
incluyendo unos 300.000 uruguayos. Debido al alarmante aumento de la prevalencia de
enfermedades metabólicas en el último siglo y al fracaso de los tratamientos farmacológicos
disponibles para contener esta pandemia, nuevas alternativas están siendo estudiadas hoy en día. La
cirugía bariátrica tiene como finalidad la pérdida ponderal en individuos obesos; pero estos
procedimientos bariátricos cuando se utilizan para tratar trastornos metabólicos, se denominan
cirugías metabólicas, y son considerados desde hace algunos años como el tratamiento más eficaz
para tratar la DM2 y otras enfermedades vinculadas al síndrome metabólico (Dislipemia e
Hipertensión arterial, entre otras).
Tras un año de la intervención quirúrgica, los pacientes obesos y diabéticos alcanzan un pico de
pérdida ponderal del 60% de su sobrepeso, mientras que ocho de cada diez logran disminuir la
Hemoglobina Glicosilada (HbA1c) a niveles normales, valores que se pueden mantener por al menos
algunos años. Si bien la mejora del metabolismo glucídico no sorprende por su estrecha asociación
con la obesidad, la remisión de la DM2 se da tras las primeras horas de la intervención de manera
independiente de la pérdida de peso corporal, mediante un mecanismo desconocido.
El Dr. Avner Leshem del laboratorio del Dr. Eran Elinav dentro del Weizmann Institute of Science de
Israel investiga los mecanismos detrás de la remisión temprana de la DM2 post cirugía en modelos
de ratones con intolerancia a la glucosa y durante mi tesis de grado tuve la increíble oportunidad de
sumarme a su equipo de trabajo.
En este proyecto se observa la temprana remisión de la DM2 y del hígado graso en ratones con
síndrome metabólico sometidos a una gastrectomía vertical en manga, contrario al resultado de la
intervención en sus pares tratados con una cirugía placebo.
Ya que ambos grupos reciben la misma cantidad de calorías en su dieta y mantienen igual peso
corporal, se remarca la posibilidad de la existencia de un mecanismo de mejora de la intolerancia a
la glucosa independiente de la pérdida de peso y de la restricción calórica ocasionada por la cirugía.
Por otra parte, se realizaron experimentos paralelos empleando dos dietas de diferente composición
nutritiva resultando en el mismo fenotipo, indicativo de un mecanismo independiente de la dieta.
Tras analizar las características clínicas individuales con el fin de entender el mecanismo involucrado
en la mejora metabólica, se descubrieron diferencias significativas en los niveles de moléculas
circulantes y en la expresión génica del hospedador. Pero fueron aún más notorios los cambios a
nivel de la composición y función del microbioma intestinal entre ambos grupos. Aún más
impactante, la cirugía no tiene ningún efecto metabólico en ratones estériles o “germ-free” lo que
sugeriría un mecanismo dependiente de la microbiota intestinal.
Si bien falta mucho por investigar y el proyecto no ha terminado, se ha establecido un modelo de
animales y cirugías muy estable, por lo que el camino está allanado para entender los mecanismos
detrás de la remisión temprana de la diabetes tipo 2 ocasionada por los procedimientos bariátricos y
así generar tratamientos innovadores y menos invasivos para combatir la pandemia de síndrome
metabólico mediante -por ejemplo- modificaciones del microbioma intestinal.
5
Palabras clave
Cirugía bariátrica y metabólica, diabetes mellitus tipo 2, síndrome metabólico, hígado graso,
medicina personalizada, microbioma intestinal.
6
Abreviaturas
ABX: antibióticos
Dbdb: lep db -/-
DIO: Diet-induced obesity
DM2 y T2DM: Diabetes Mellitus Tipo 2
dNTPS: deoxiribonucleotido trifosfatos
GF: Germ-free
HCD: high carbohydate diet
HFD: high fat diet
HOMA-IR: (del inglés homeostatic model assessment Insulin Resistance) modelo
homeostático para evaluar la resistencia a la insulina
Ko: knock-out
M.o.: microorganismos
MAG: Metagenome Assembled Genome
mM: milimolar
NC: normal chow
Ns: no significativo
NGS: Next Generation Sequencing
PBS: (del inglés phosphate buffered saline)Tampón fosfato salino
PFA: Parformaldehído
SBS: Sequencing By Synthesis
SCFA: Short Chain Faty Acids
SPF: Specific pathogen free
Tracto GI: Tracto Gastrointestinal
TTG: Test de tolerancia a glucosa
TTI: Test de tolerancia a insulina
WT: Wild-type
7
Índice
1. Introducción .................................................................................................................................. 11
1.1 Diabetes Mellitus Tipo 2 ............................................................................................................. 11
1.1.1 Definición ............................................................................................................................. 11
1.1.2 Glucemia .............................................................................................................................. 13
1.1.3 Insulina ................................................................................................................................. 14
1.1.4 Métodos de prevención y tratamiento disponibles............................................................. 16
1.2 Microbioma intestinal ................................................................................................................. 17
1.2.1 Definición ............................................................................................................................. 17
1.2.2 Estudio de las microbiotas ................................................................................................... 19
1.2.3 Relación con el metabolismo humano................................................................................. 22
1.2.4 Aplicaciones biotecnológicas ............................................................................................... 23
1.3 Procedimientos bariátricos ......................................................................................................... 25
1.3.1 Definición ............................................................................................................................. 25
1.3.2 Reportes de resultados en humanos ................................................................................... 27
1.3.3 Efectos metabólicos de la cirugía......................................................................................... 28
1.3.4 Riesgos de la cirugía ............................................................................................................. 30
2. Objetivos ....................................................................................................................................... 31
2.1 Objetivo general.......................................................................................................................... 31
2.2 Objetivos específicos................................................................................................................... 31
3. Metodología .................................................................................................................................. 32
3.1 Ratones ....................................................................................................................................... 32
3.2 Definición de dos grupos de individuos ...................................................................................... 32
3.3 Gastrectomía vertical en manga ................................................................................................. 33
3.4 Alimentación en par .................................................................................................................... 35
3.5 Prueba de la tolerancia a glucosa ............................................................................................... 36
3.6 Prueba de la tolerancia a insulina ............................................................................................... 37
3.7 HOMA-IR ..................................................................................................................................... 37
3.8 Cuantificación de moléculas de interés en el plasma sanguíneo ............................................... 37
3.9 Composición corporal ................................................................................................................. 38
3.10 Histología del hígado................................................................................................................. 38
3.11 Análisis calorimétrico de la materia fecal ................................................................................. 38
8
3.12 Análisis transcriptómico del intestino e hígado ........................................................................ 39
3.13 Análisis de la composición del microbioma intestinal .............................................................. 39
3.14 Gráficos y análisis estadísticos .................................................................................................. 40
3.15 Esquemas explicativos .............................................................................................................. 40
3.16 Recolección de datos clínicos de pacientes humanos .............................................................. 40
3.17 Entrevistas a pacientes uruguayos sometidos a la cirugía........................................................ 41
3.18 Trasplante de materia fecal ...................................................................................................... 41
4. Resultados Obtenidos ................................................................................................................... 42
4.1 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de ratones wild-type con
síndrome metabólico inducido por una dieta alta en grasa ............................................................. 42
4.1.1 Diseño experimental y caracterización fisicoquímica de los individuos previo al
tratamiento ................................................................................................................................... 42
4.1.2 Seguimiento de la ingesta dietética y peso corporal luego de la cirugía ............................. 44
4.1.3 Prueba de tolerancia a la glucosa ........................................................................................ 44
4.1.4 Prueba de tolerancia a la insulina ........................................................................................ 45
4.1.5 Concentración de insulina en la sangre luego de la cirugía ................................................. 46
4.1.6 Composición corporal antes y después de la cirugía ........................................................... 47
4.1.7 Histología del hígado luego de la cirugía ............................................................................. 48
4.1.8 Cuantificación de incretinas y moléculas de interés circulantes luego de la cirugía ........... 49
4.1.9 Cuantificación de ácidos biliares luego de la cirugía............................................................ 50
4.1.10 Energía cosechada de la dieta luego de la cirugía ............................................................. 51
4.1.11 Análisis transcripcional del hígado e intestino luego de la intervención ........................... 52
4.1.12 Análisis del microbioma intestinal luego de la intervención ............................................. 56
4.2 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de ratones wild-type con
síndrome metabólico inducido por una dieta alta en grasa privados de microorganismos en el
tracto gastrointestinal....................................................................................................................... 62
4.2.1 Diseño experimental y caracterización del microbioma previo al tratamiento .................. 62
4.2.2 Prueba de tolerancia a glucosa ............................................................................................ 63
4.2.3 Confirmación del fenotipo observado en individuos Germ-Free ........................................ 64
4.3 Efectos de la gastrectomía vertical en manga sobre un modelo de ratones lep db -/- con
síndrome metabólico inducido por una deleción genética .............................................................. 66
4.3.1 Diseño experimental y caracterización fisicoquímica de los individuos previo al
tratamiento ................................................................................................................................... 66
4.3.2 Seguimiento de la ingesta dietética y peso corporal luego de la cirugía ............................. 67
4.3.3 Prueba de tolerancia a glucosa ............................................................................................ 68
9
4.3.4 Concentración de insulina en la sangre luego de la cirugía ................................................. 69
4.3.5 Cuantificación de incretinas y otras moléculas circulantes de interés luego de la cirugía .. 70
4.3.6 Cuantificación de ácidos biliares luego de la cirugía............................................................ 71
4.3.7 Energía cosechada de la dieta luego de la cirugía ............................................................... 71
5. Discusión ....................................................................................................................................... 73
5.1 Efectos de la cirugía sobre la resistencia a la glucosa ................................................................. 73
5.2 Efectos de la cirugía sobre la resistencia a la insulina ................................................................ 74
5.3 Efectos de la restricción de la ingesta calórica y de la pérdida de peso corporal luego de la VSG
.......................................................................................................................................................... 74
5.4 Efectos de la VSG sobre la reducción de grasa corporal ............................................................. 75
5.5 Cambios en los niveles de moléculas de interés circulantes en el plasma de los individuos luego
de la VSG ........................................................................................................................................... 75
5.6 Cambios en los ácidos biliares circulantes en el plasma del individuo luego de la VSG ............. 76
5.7 Cambios en la energía cosechada de la dieta luego de la VSG ................................................... 77
5.8 Cambios en la expresión génica asociada a la VSG ..................................................................... 77
5.9 Cambios en la composición del microbioma intestinal asociados a la VSG y rol en el mecanismo
de la mejora metabólica observada.................................................................................................. 78
6. Conclusiones ................................................................................................................................. 82
7. Perspectivas .................................................................................................................................. 83
8. Referencias bibliográficas ............................................................................................................. 84
9. Anexos ........................................................................................................................................... 94
101. Introducción
1.1 Diabetes Mellitus Tipo 2
1.1.1 Definición
La Diabetes Mellitus Tipo II (DM2) es uno de los mayores problemas para Salud Pública del siglo 21
que afecta al 8% de los adultos (1) en el Mundo incluidos unos 300 mil uruguayos (2–4). Además, 30-
40% de los adultos (lo que significa 300.000 uruguayos) sufren prediabetes, una condición que
precede la DM2 (70% de pre diabéticos desarrollan DM2) caracterizada por altos niveles de azúcar
en sangre (2,5). Así, se espera que la prevalencia de la DM2 en la población mundial continúe
creciendo de manera significativa como la ha hecho en el último siglo, estimando 700 millones de
enfermos para el 2045 (6). Todo esto representa un gasto de 850 billones de dólares por año para
tratar esta pandemia (7,8) por lo que existen enormes esfuerzos para frenarla.
Se define a la DM2 como un conjunto de trastornos metabólicos, cuya característica común principal
es la presencia de concentraciones elevadas de glucosa en la sangre de manera persistente o crónica
debido a un defecto en la producción de insulina, o a una resistencia a la acción de ella para utilizar
la glucosa (insulino resistencia), o a un aumento en la producción de glucosa o a una combinación de
todas estas (9). Así, las células del cuerpo no logran incorporar la glucosa presente en el suero y ésta
se acumula en la sangre, en el riñón y finalmente en la orina –conocido como glucosuria. El
desenlace típico de la enfermedad conlleva el desarrollo de una afectación vascular de distinta
índole y localización, así como la neuropatía diabética que deriva en trastornos neurológicos en la
parte distal de las extremidades (pies y manos), enfermedad renal, retinopatía (ceguera progresiva)
y coronariopatía (infarto agudo de miocardio) a mediano y largo plazo (10). Así, la esperanza de vida
de los pacientes que padecen esta enfermedad disminuye de cinco a diez años, lo que explica que en
la era del COVID-19 las personas con diabetes ocupan el primer lugar en la lista de muertes por
COVID-19 al entrar al hospital (11,12).
En 1980 Gerald Reaven propuso el concepto de síndrome metabólico definido como un grupo de
anormalidades metabólicas comunes a la DM2, la obesidad y las enfermedades cardiacas que
parecen ser exacerbadas por el consumo de azúcar, harina y otros carbohidratos fáciles de digerir.
Lo asoció a diversos tipos de cáncer y Alzheimer y definió su origen en los cambios bruscos del estilo
de vida y nutrición del Humano acompañado de la globalización.
Este cambio en los hábitos alimenticios se atribuye a las enormes industrias alimentarias que, para
satisfacer los requerimientos nutricionales de la población mundial, han creado la comida chatarra o
ultra procesada. Son formulaciones de insumos baratos que contienen poca comida natural,
requieren un proceso de fabricación y se caracterizan por ser hiperpalatables, baratos, llenos de sal y
sobre todo: listos para consumir (13). La facilidad que este tipo de alimento ofrece para muchas
personas y su enorme disponibilidad en cualquier góndola de supermercado ha descontrolado el
consumo de alimentos ultra procesados llenos de azúcares y sobre todo fructosa -presente en la
mayoría de bebidas azucaradas de venta libre al público. Hoy en día, es más barato consumir este
tipo de alimentos que comida no procesada (por ejemplo, sin lista de ingredientes en el paquete) lo
que también se asocia a mayor prevalencia en la población de escasos recursos (14).
11Para poner en contexto, actualmente es más probable morir de una enfermedad metabólica que por
un acto criminal (15), como lo define el israelí Yuval Harari en su libro Homo Deus: Coca-Cola
representa un mayor riesgo que al Qaeda y hamas, existiendo hoy en día más muertes por diabetes y
obesidad que por violencia y/o terrorismo.
121.1.2 Glucemia
La glucemia es la medida de concentración de glucosa libre en la sangre y su valor en individuos sin
diabetes varía entre 70mg/dl y 99 mg/dl. El cerebro se alimenta principalmente de glucosa y en caso
de que el valor de la glucemia sea inferior a 70 mg/dl (hipoglucemia), este órgano no tiene suficiente
energía. Ante la hipoglicemia el organismo desarrolla una serie de respuestas de manera escalonada.
El primer mecanismo de defensa desencadenado es el cese de producción de insulina en las células
B del páncreas. En segundo lugar, el aumento de la secreción de glucagón y la producción de
epinefrina (adrenalina) ormo me g em me e o me mo
me ro e e g o me e g o eog e g oge
Disminuyen la captación periférica de glucosa. 3) Inhiben la secreción de insulina. Por otra parte,
cuando la glucemia excede los 100 mg/dl (hiperglucemia), alcanzando -en algunos casos- valores
próximos a 200 mg/dl durante muchos años consecutivos, se forman compuestos como especies
reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) que causan estrés oxidativo o los productos
finales de glicación (AGE por sus siglas en inglés) que se acumulan en tejidos afectados por la
diabetes y generan los problemas vasculares descritos arriba.
Se han desarrollado diversas técnicas para medir la glucemia y así conocer el estado metabólico del
individuo y –en caso de ser necesario- tomar las medidas para corregirla. En los 1970s Anthony
Ceramin y Frank Bunn de la Universidad de Rockefeller demostraron que los pacientes diabéticos
tienen una concentración dos o tres veces mayor de una forma de hemoglobina inusual en
individuos sanos denominada Hemoglobina Glicosilada o HbA1c. Esta molécula es una
heteroproteína resultante de la unión de la hemoglobina con moléculas de glucosa y es la medida
más acertada para determinar si el paciente ha manejado bien la glucemia en los últimos (tres)
meses, ya que los glóbulos rojos, que contienen la hemoglobina, tienen una vida media entre 90 y
120 días en el organismo. Por otra parte, el glucómetro permite medir la glucemia de manera
instantánea sin necesidad de personal capacitado. En la actualidad, se han desarrollado monitores
continuos de glucemia que censan el nivel de glucosa en sangre (más precisamente en el líquido
intersticial) cada 5 minutos sin necesidad de punciones.
Mientras que la glucosa de la dieta pasa a la circulación sanguínea aumentando la glucemia, otros
azúcares como la fructosa, no lo hacen, aunque también tienen un efecto diabetogénico. Estos se
almacenan directamente en el hígado y se convierten en triglicéridos aumentando las chances de
desarrollar un hígado graso y de enfermedades cardiovasculares por aumento del colesterol LDL que
los transportan. Además, la fructosa bloquea el metabolismo de glucosa en el hígado y la síntesis de
glucógeno por lo que el páncreas secreta más insulina generando insulino resistencia en el musculo
esquelético con un efecto diabetogénico al igual que la glucosa aunque sin aumentar la glucemia. Se
evidencia el impacto de la dieta moderna (basada en alimentos y bebidas llenas de fructosa
consideradas sanas por no aumentar la glucemia) sobre la salud metabólica de la población y su
relación con la pandemia de síndrome metabólico.
131.1.3 Insulina
El descubrimiento de la insulina se dio al final del siglo XIX, cuando se asoció el páncreas como
órgano responsable de la DM2 para, luego, en los 1920's definir a la insulina como la hormona
causante de la enfermedad. Se trata de una hormona polipeptídica producida y secretada por las
células beta de los islotes de Langerhans del páncreas cuya principal función es favorecer la
incorporación de la glucosa de la sangre hacia las células en respuesta a una glucemia elevada.
La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune en la que el organismo ataca las células beta del
páncreas eliminándolas e impidiendo así la producción de esta hormona. En el pasado un 1% de los
niños presentaban esta enfermedad de forma espontánea y morían, hasta 1921, cuando un equipo
de la Universidad de Toronto descubrió la hormona y la nombró “ ”, er v o e r íz
e br “ e o ” o q e e v e Prem o Nobe e F o ogí Me e 9 3 Por o r
parte, la DM2 implica una producción insuficiente de insulina por las células beta.
En 1960, Rosalyn Yaloe (Premio Nobel en Fisiología y Medicina en 1977) descubrió un método para
medir la insulina en sangre, que permitió demostrar la elevada concentración de esta hormona en
individuos pre diabéticos, obesos e hipertensos causada por la insulino resistencia de algunos
tejidos. Actualmente, se puede medir la insulina y su actividad en el organismo mediante diversas
técnicas como el HOMA-IR, que evalúa si existe un bloqueo o resistencia periférica a la acción de la
insulina ya que, en condiciones normales, existe un equilibrio entre la gluconeogénesis y la secreción
de insulina por las células beta del páncreas.
La resistencia a la insulina se da por una disminución de la función biológica de esta hormona que
obliga a generar un incremento en sus concentraciones plasmáticas con el fin de mantener la
homeostasis de la glucemia. Las células generan resistencia a moléculas que están presentes en el
medio en exceso por un tiempo prolongado para evitar el efecto de tan fuerte señal y equilibrar el
metabolismo celular. Es así que niveles de insulina elevados por un largo periodo de tiempo dan
lugar a resistencia a insulina. Los receptores de insulina presentes en las células son removidos de la
superficie celular o modificados químicamente generando una unión más débil. Este fenómeno se
o o e omo “ ow -reg o ” e q eb r omeo Sin embargo,
es un factor de riesgo para la DM2 por el alto nivel de glucemia consecuente ya que, de este modo,
más insulina es requerida para disminuir la glucemia. Por esto, se han desarrollado fármacos para
combatir la diabetes mediante la estimulación de la producción de insulina.
En sujetos sanos el nivel de insulina en el organismo está regulada por múltiples mecanismos que
evitan la hipoglucemia: uno de los (tantos) problemas ocasionados por niveles altos de insulina. Esta
hormona es degradada por el organismo luego de 30 minutos y los principales sitios de degradación
son el hígado y el riñón mientras que la orina su canal de salida. La IDE (del acrónimo inglés: Insulin
Degrading Enzyme) es la encargada de romper la insulina en exceso y además elimina la proteína
amiloidea. Por lo que si hay exceso de insulina en el cerebro, la IDE no logra eliminar la sustancia
amiloidea y se puede desarrollar Enfermedad de Alzheimer en el largo plazo. Ratones knock-out para
IDE desarrollan DM2 y Alzheimer de donde se conoce a esta enfermedad como la Diabetes Mellitus
Tipo 3 (16).
Mientras que se pensaba que la única función de la insulina era disminuir la glucemia, hoy en día se
conocen diversas funciones de esta hormona en el metabolismo humano y se ha asociado a diversos
14problemas de salud, por ejemplo con la pandemia de obesidad. A pesar de que las causas de la
obesidad en humanos se desconocen, por el aumento de su prevalencia en el último siglo podría
asociarse a los cambios en los hábitos alimenticios, ya que tendemos a comer cada vez más
carbohidratos. El autor neoyorquino Gary Taubes describe una muy aceptada y probada (aunque
refutada también por otros científicos) teoría de la causa de esta enfermedad: el modelo
carbohidratos-insulina. Se basa en un aumento del nivel de grasa almacenada en el tejido adiposo
debido a la alta concentración de insulina generada por elevados picos de glucemia postprandiales
de dietas altas en carbohidratos. Al desabastecer la sangre de carbohidratos, el cerebro aumenta la
necesidad de consumir calorías generando sensación de hambre en el individuo que tiende a comer
más de lo necesario y reducir el gasto energético por la fatiga que lleva al sedentarismo. Así, las
recomendaciones médicas de comer menos y moverse más generarían un impacto adverso según
este modelo. Se cuestiona entonces el tan impuesto “efe o o vo” e gr e en
nuestra sociedad (por empresas como Coca-Cola), tornando las miradas hacia el azúcar, en su lugar
(17).
Por otra parte, la hipertensión arterial se acompaña de un elevado nivel de insulina en sangre que
genera la reabsorción del sodio (y por ende agua) en el riñón en lugar de excretarse por la orina,
aumentando la presión sanguínea por la retención hídrica. Además, la insulina se asocia al concepto
e “f or f g ” e re , or o q e o e r e ev e gre v em
nervioso, aumenta el ritmo cardiaco y por ende la presión sanguínea, de donde algunos autores
cuestionan e f mo o og “me o m v ” impuesto en todo el Mundo.
Además, la insulina juega un papel importante en el crecimiento de los tejidos y por ende también
para el desarrollo de tumores, de donde se podrían asociar la DM2 y el cáncer (18). Las células
tumorales presentan más receptores de insulina que las células normales, lo que les da la posibilidad
de absorber mayor cantidad de glucosa de la sangre y así crecer más. La IGF (del acrónimo inglés:
Insulin-like Growth Factor) es una hormona similar en estructura a la insulina que puede mimicar sus
efectos y es requerida por casi todos los tejidos del organismo para crecer. Mientras que la IGF
inhibe mecanismos de muerte celular programada (favoreciendo el desarrollo de tumores), los
tumores sobre expresan receptores de IGF y de insulina. En sangre, los IGF viajan unidos a una
proteína y así su tamaño es demasiado grande para interactuar con la célula. Sin embargo, la insulina
hace que esta unión se disuelva, creando más IGF disponible para el crecimiento tisular -y tumores
también por ende. De esta manera, tanto la IGF como la insulina son un mecanismo de defensa de la
especie humana: ante falta de comida -censado por baja insulina- se activa un modo de
supervivencia evitando generar progenie (se observa la desaparición de la menstruación) y el
crecimiento de los tejidos.
151.1.4 Métodos de prevención y tratamiento disponibles
Una rama de la biomedicina busca desarrollar tratamientos para combatir esta pandemia. La
potencialidad de estas metodologías se mide en base a la capacidad para regular la HbA1c y se
dividen en tres grandes categorías: modificaciones del estilo de vida, farmacoterapia y cirugía
mediante procedimiento bariátricos o cirugía metabólica (19–21).
A nivel farmacológico las inyecciones de insulina son una alternativa de tratamiento para la DM2,
aunque existen varios antidiabéticos orales cuyo nivel de administración varía de país a país y mismo
de médico a médico (22). Es posible dividirlos según su efecto en 1) las sulfonilureas o meglitinidas
que estimulan la secreción de insulina por el páncreas. 2) las biguanidas, que logran reducir la
glucemia por un mecanismo de acción desconocido. 3) Además, se desarrollaron otros fármacos
como los análogos de la incretina GLP-1 que estimulan la secreción de insulina postprandial o 4) los
inhibidores de DPP-4 que bloquean la degradación de las incretinas. Los inhibidores de SGLT2
también son un increíble descubrimiento que evita la reabsorción de la glucosa en el riñón
favoreciendo la glucosuria.
Mientras que la mayoría de los individuos con DM2 son tratados con metformina (22,23)– una
biguanida oral que es el octavo fármaco más vendido en USA (24)-, existe una corriente que opta por
métodos tradicionales como comer menos y mejor (haciendo referencia a la famosa frase de
Hipócrates “ r om omo r m e o”) o hacer más ejercicio físico. Sin embargo, debido al
fracaso de la gran mayoría de los tratamientos higiénico-dietético-alimentarios y farmacológicos
disponibles, nuevas opciones han sido estudiadas, siendo hoy en día la cirugía metabólica la de
mayor eficacia (25,26). Vale destacar que el efecto de esta cirugía no es mágico y varía según el
paciente y su disciplina luego del tratamiento (27).
Por otra parte, un alto porcentaje de los enfermos no son diagnosticados (28) y cada vez más se
aprecian enormes esfuerzos por desarrollar metodologías novedosas de prevención que combinan
datos clínicos con técnicas de aprendizaje automático para predecir el desarrollo de la enfermedad
y tratarla a tiempo (29,30). Este tipo de aproximaciones permitirá también generar predictores de la
respuesta individual a los tratamientos tanto farmacológicos como quirúrgicos disponibles,
facilitando su adecuada elección y evitando su fracaso.
161.2 Microbioma intestinal
1.2.1 Definición
La microbiota intestinal es el conjunto de trillones de microorganismos (bacterias, fungi, protozoos y
virus) que habitan el tracto gastrointestinal para formar el holobionte de células procariotas y
eucariotas q e m mo “ er m o” z e ger r e eme tos de la dieta que nuestra parte
eucariota no podría y sirve como un centro de señalización al generar moléculas que pasan a la
circulación sanguínea e interactúan con diversos sistemas en todo el organismo para cumplir un rol
fundamental -tanto en salud como en enfermedad- en la regulación de múltiples procesos
fisiológicos (16,31–35).
La gran diversidad de organismos y la imposibilidad de cultivarlos in vitro limitó el conocimiento de
la composición de esta flora intestinal hasta los comienzos del siglo XXI, cuando el avance de la
biología molecular y del poder de secuenciación dieron lugar a la metagenómica. Hoy en día es
posible definir cada microorganismo de una muestra, su abundancia relativa y su función, aunque el
significado sobre la salud humana no es claro y genera confusiones por lo que es un campo de
estudio nuevo con mucho por descubrir aún.
La composición y función de la microbiota intestinal se forma desde el nacimiento, tras el primer
contacto del recién nacido con los microorganismos del canal de parto de la madre, que sirven de
inóculo para su tracto gastrointestinal (36). En caso de nacimiento por cesárea (1 de 4 bebés), los
microorganismos de la piel de la madre, de los médicos y del aire del hospital (37) se encargan de
colonizar el tracto gastrointestinal aún estéril del bebé, lo que influye mucho al desarrollo de la
microbiota del adulto y se asocia con enfermedades crónicas (principalmente alergias) en la adultez.
Y q e e m rob om e “e ” em m e e beb (38) (y también del adulto
(39,40) , e e e oq ee o o o “ b o ” ( rm o o rover , ex o e e
sufran enfermedades crónicas y alergias. El mismo problema se estima en niños que pasan su
infancia encerrados en la casa durante la pandemia de COVID-19 cuya microbiota no logra
diversificar sus bacterias debido a la falta de exposición, siendo un problema secundario de este
coronavirus.
Se estima que el intestino aloja unas 10^14 células, siendo el componente principal las bacterias,
pero también otros (micro) organismos como hongos, arqueas y una cantidad desconocida de virus
ef o omo “v rom ” De e o, e aproxima a unas 10 veces el número de células eucariotas
humanas de un adulto promedio, siendo el colon humano uno de los hábitats más densamente
poblado de microorganismos del mundo con una concentración de entre 10^11 y 10^12 de
microorganismos por mL, que representan un peso total de 2.5 kg (igual al del cerebro, de dónde se
lo define como o ro “ rg o” e ro e org mo o o omo “e eg o erbero” , debido a
que su tamaño celular es 10^6 veces menor que una célula humana.
La increíble diversidad genética de 3 millones de genes que definen el metagenoma intestinal
comparado a los 25 mil del genoma humano deja en evidencia la coevolución humano-
microorganismos que suponen complementar sus funciones fisiológicas. De hecho, estudiar genética
humana involucra apenas un 1% de todo el material genético que llevamos dentro nuestro y de ahí
lo apasionante de esta área de estudio (41).
17Si bien la composición del microbioma intestinal es bastante estable en el tiempo, varía
dependiendo de la persona, la ubicación geográfica e incluso la hora del día (42–44). Se observa en
algunos casos una composición bacteriana similar en individuos con mismo estilo de vida como los
trabajadores nocturnos o los tripulantes de avión en quienes la disrupción del reloj circadiano (jet-
lag) aparea cambios en la micro flora asociados a un mayor riesgo de padecer enfermedades
metabólicas (45–48). Ingerir alimentos y defecarlos es otra gran fuente de variaciones de la
composición microbiana. El hombre promedio ingiere alrededor de un millón de microorganismos,
simbiontes y/o patógenos, por gramo de comida ingerida. Sin embargo, no todos logran colonizar el
tracto GI ya que en el lumen intestinal deben lidiar contra el sistema inmune del hospedador pero
también con los otros microorganismos que ya colonizaron la mucosa de la lámina propia. Así, la
microbiota intestinal se moldea dependiendo de varios factores y, en consecuencia, no todos los
probióticos comerciales garantizan colonizar el intestino y ejercer la función pensada dejando sin
v or “ rob o ver ” ero ndo hacia un futuro en el que se pueda predecir
formulaciones de bacterias útiles a nivel personal (49).
En la última década se demostró una relación de causalidad del microbioma intestinal con
enfermedades metabólicas tales como Diabetes Mellitus tipo 2 y obesidad (37,50–52), marcando un
mb o e r gm obre e ferme e “ o r m b e ” (53–55) y para la nutrición. Sin
embargo, es un tema de estudio muy reciente por lo que queda definir algunos conceptos claves
como ¿qué es un m rob o “ ”? ¿C mo e e e ef r “ b o ”? A mo o e ejem o,
se observa un cambio composicional en las embarazadas cuyas especies dominantes se asemejan a
las proporciones presentes en individuos con síndrome metabólico que cosechan mayor energía de
la dieta y elevan la glucemia con el fin de otorgar la mayor cantidad de nutrientes para al feto (56).
Además, el mal uso de antibióticos tanto en humanos como en animales aparea enormes desafíos
para el área de las microbiotas creando la necesidad de contrarrestar los efectos nocivos sobre el
microbioma. A modo de ejemplo, los 58.000 años de coevolución con H. pylori parecerían estar
llegando a su fin debido al uso indiscriminado de antibióticos. No menos importante es la aparición
de bacterias multi resistentes a antibióticos o “ ú er b g” o idad patológica que se estima
podrán causar la próxima gran pandemia de la era post-antibiótico.
181.2.2 Estudio de las microbiotas
Debido al increíble avance del conocimiento sobre las microbiotas del cuerpo humano y su impacto
en el hospedador, el número de investigaciones aumenta año tras año. Ya que es interesante
entender qué bacterias están presentes en la muestra, el primer paso del análisis en casi todos los
casos de estudio es la asignación taxonómica para lo que se distinguen básicamente tres métodos.
La secuenciación masiva o por shotgun que permite identificar bacterias y virus a nivel de especies e
incluso cepas pero requiere acceso a bases de datos de referencia pesadas y es la más costosa; la
secuenciación del 16s del ARN ribosomal que permite la identificación -a nivel de género- de
múltiples organismos en una misma PCR pero se limita a bacterias y arqueas; y la identificación de
organismos específicos por qPCR con sus primers que requiere poner a punto el proceso para evitar
reacciones cruzadas dentro de la muestra (57–59).
Al profundizar sobre las técnicas de secuenciación masiva, los secuenciadores de la marca Ilumina
lideran el mercado siendo responsables de aproximadamente el 90% de los datos generados en el
Mundo (60). Mientras que las maquinas evolucionan mejorando la calidad de las secuencias
obtenidas, todas funcionan con el mismo principio: secuenciación por síntesis o “SBS”. Esta
metodología incluye cuatro pasos fundamentales. La preparación de la librería consiste en
fragmentar la secuencia de ADN en porciones más cortas al azar y agregarles adaptadores en los
ex remo 3’ 5’ que contienen un sitio de unión e eb or “ e e e r ” r
enganchar la secuencia al soporte del secuenciador. La librería se desnaturaliza (para obtener
secuencias de ADN simple hebra) y se carga sobre una celda de vidrio funcionalizada previamente
con secuencias de ADN complementarias a los adaptadores que se unen por ambos extremos
formando una estructura con forma de puente. Así, al agregar una ADN polimerasa se logra generar
clústeres de cada secuencia repetida alrededor de 1000 veces en un único punto de la celda de
v r o, me e “ o mer z e e e” dejando el ADN listo para secuenciar. La técnica SBS se
basa en la acción de la ADN polimerasa de incorporar dNTPs etiquetadas e e ex remo 3’ con un
fluoróforo identificatorio a las secuencias de cada clúster. Para cada ciclo se obtiene una imagen de
la luz emitida por cada clúster con la ayuda de un microscopio y así se determina la base presente en
esa posición, siendo la ventaja de secuenciar todo el clúster en paralelo el obtener una señal
lumínica más fuerte y detectable. Este proceso se repite obteniendo las secuencias de interés y los
datos obtenidos se registran en forma de archivo bcl generado a partir de las señales lumínicas que
se convierte en un archivo de texto del tipo FASTQ, conteniendo las secuencias representadas con
letras A, C, G y T para analizar.
Junto a estas técnicas se han desarrollado decenas de softwares (disponibles para diversos lenguajes
de programación) para extraer información relevante. Por ejemplo, pipelines para la asignación
taxonómica de los organismos de la muestra analizada tales como Kraken o Metaphlan que siguen
distintas metodologías para asignar la taxonomía correspondiente a cada secuencia de la muestra
obtenida por secuenciación masiva o shotgun. El resultado de la secuenciación son fragmentos de
ADN correspondiente a las bacterias (para simplificar, se adelanta que se elimina toda la información
genética de los organismos pertenecientes a otros dominios que bacteria) presentes en la muestra
denominados reads. Por un lado, Kraken busca alinear estos reads (k-mers) con el ancestro común
más bajo de todos los genomas de la base de datos que contengan ese k-mer identificando el taxón
correspondiente. Por el otro lado, la estrategia de Metaphlan es detectar secuencias de genes
19marcadores típicos del clado para determinar la bacteria a la cual pertenece cada read analizado.
Dependiendo del objetivo del estudio es que se elige la herramienta bioinformática óptima.
Para poder entender los resultados de la secuenciación se han desarrollado algoritmos capaces de
computar la abundancia relativa de cada bacteria (a nivel de especie, género, etc.) presente en la
muestra. Mientras que Metaphlan3 incluye esta característica, Kraken se complementa con Bracken
(Bayesian Reestimation of Abundance with KrakEN) para esta actividad.
A su vez, se aplican diferentes métodos estadísticos para analizar la biodiversidad de las muestras
como la alfa y beta diversidad. Mientras que la primera es una medida de la diversidad dentro de la
muestra (qué especies están presentes y en qué abundancia relativa) la segunda es una medida de
diversidad entre dos muestras (qué tan diferentes son). A modo de ejemplo, el índice de Shannon es
una métrica para la alfa diversidad que combina riqueza y diversidad. Cuanto mayor sea este valor,
mayor es la cantidad de especies con similar (o al menos valores balanceados) abundancia relativa
en la muestra. El valor va de 1 (en caso de haber una única especie dominante) hasta el total de
especies en la muestra (en caso de que todas las especies tengan una idéntica AR). El índice de
Simpson también es usado para analizar la diversidad de una muestra y, según Wikipedia,
representa la probabilidad de que dos individuos dentro de un hábitat seleccionados al azar
pertenezcan a la misma especie. Es decir, cuanto más se acerca el valor de este índice a la unidad,
existe una mayor posibilidad de dominancia de una especie y de una población; y cuanto más se
acerque el valor de este índice a cero mayor es la biodiversidad de un hábitat. Por el otro lado, se
emplean otros índices para calcular la beta diversidad como el Bray-Curtis o el Chaos 1 que muestra
diferencias entre comunidades microbianas basadas en la información filogenética y sus
abundancias relativas.
A pesar de que la asignación taxonómica y la definición de abundancia relativa sean suficientes para
responder algunas preguntas de interés, en la mayoría de casos se requiere la regeneración de la
secuencia de ADN completa de cada bacteria presente en la muestra. Para esto existen técnicas de
binning que logran agrupar reads superpuestos en secuencias más grandes de ADN llamados contigs.
Luego, estos contigs se agrupan según su especie para formar MAGs, del inglés Metagenome-
assembled genomes, que son representaciones del cromosoma bacteriano. Así, es posible conocer la
información genética –y por ende sus funciones- de la muestra y no solo la taxonomía de las
bacterias allí presentes. A modo de ejemplo, el pipeline HUMAnN 3 para Python logra asignar la
abundancia relativa de los genes y las vías metabólicas bacterianas presentes en la muestra
secuenciada, a partir de los millones de reads obtenidos de la secuenciación masiva (61). En este
caso, los reads son alineados con bases de datos de las redes de interacciones moleculares dentro de
las células o KEGG pathways (62). De todos modos, es muy difícil lograr buenas representaciones
debido a que los reads analizados podrían no cubrir todo el genoma, de especies cuya abundancia
relativa (y por ende reads correspondientes) es baja en la muestra (63,64). De todos modos, esta
técnica es cada vez más explotada en el sector ya que debido a la rápida evolución de las bacterias
(comparado con la genética humana), ejemplares de la misma especie pueden presentar diferente
información genética otorgando distintas funciones a la comunidad bacteriana en la que se
encuentren. Además, mediante asignación taxonómica es imposible identificar los elementos
genéticos móviles (ej.: plásmidos) que se caracterizan por brindar a la célula genes de resistencia
antimicrobiana y factores de virulencia que impactan de forma directa en la salud del hospedador.
20Por otra parte, es posible identificar bacterias o proteínas (ej.: enzimas con potencial biotecnológico)
desconocidas hasta el momento que no estén reportadas en ninguna base de datos.
Por otra parte, el cultivo de microorganismos en un laboratorio se hace necesario para responder
algunas preguntas (65–67). Así, se han realizado enormes esfuerzos en mimicar las condiciones
ambientales del intestino mediante, por ejemplo, cámaras de anaerobiosis, entre otros. La
posibilidad de generar un biobanco de bacterias con funciones metabólicas asociadas es una
oportunidad enorme para el campo de los probióticos y el objetivo de investigadores prestigiosos.
Por último, cabe destacar que el estudio del microbioma intestinal presenta otras limitaciones que
imposibilitan la explotación del conocimiento al día de hoy (68,69) aunque se estima en unos años el
campo evolucionará positivamente. Es sabido que la composición microbiana varía a lo largo de todo
el tracto gastrointestinal por lo que analizar una muestra de materia fecal no es representativo de la
microbiota intestinal. Para eso, hay grandes esfuerzos por desarrollar algoritmos de aprendizaje
automático que, a partir de muestras fecales no invasivas, logren generar un mapa del contenido
microbiano de cada región del tracto gastrointestinal para conocer esta información sin necesidad
de un muestreo invasivo. Además, no es posible conocer la cantidad exacta de cada microorganismo
(m.o.) en la muestra, solamente su abundancia relativa.
211.2.3 Relación con el metabolismo humano
La microbiota intestinal ha demostrado estar estrechamente ligada al metabolismo de su
hospedador humano (70). Una corriente científica liderada por Justin Sonnenburg asocia el increíble
aumento de la prevalencia de e ferme e me b ( e r omo “ e or e ombre”
el estado de inflamación crónico en los habitantes de los países denominados como WEIRD
(Westernized, Educated, Industrial, Rich and Democratic) a un común denominador: disbiosis de la
microbiota intestinal generada por el estilo de vida en estos lugares. Para respaldar el concepto,
basta con analizar los cambios de las microbiotas que acompañan la globalización al comparar
microbiomas de habitantes de áreas rurales contra las de los de ciudades, y observar los rasgos
característicos del microbioma intestinal en pacientes con un sinfín de enfermedades metabólicas
tales como enfermedad inflamatoria del intestino, Alzheimer, Parkinson, ELA, depresión, ansiedad,
asma y sobre todo en obesidad y diabetes tipo 2 entre muchas otras (16,71). De todos modos, es
imposib e ef r e m rob o omo “ b ” q e queda mucho camino por recorrer en
este campo de estudio y no se cono e o q e erí m rob o “ ” ni si será posible
universalizar este concepto.
Para profundizar, se han reportado varios estudios que asocian ciertas bacterias intestinales con el
nivel de glucosa en sangre y la insulinorresistencia (72–76) en varios escenarios tales como al 3er
mes de gestación (37) y la ingesta de edulcorantes no calóricos (51) entre otros. Además, ha
demostrado mediar los efectos anti-diabetes de varios medicamentos. Asimismo, el trasplante de
materia fecal (FMT) de un donante flaco mejora la insulino resistencia en humanos obesos, lo que
sugiere la importancia de la microbiota en los mecanismos de homeostasis de la glucemia y sugiere
que el microbioma podría ser la causa la enfermedad (y/o de la cura).
22También puede leer
