TAXONOMIA MOLECULAR DE DIATOMEAS DEL ECUADOR MEDIANTE CÓDIGOS DE BARRAS DE ADN - PORTILLA, Daniela; MOYÓN, Jennifer; CHAMORRO, Susana; NAVARRO ...
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Laboratorio de
Investigación (FCNA)
TAXONOMIA MOLECULAR DE DIATOMEAS DEL ECUADOR
MEDIANTE CÓDIGOS DE BARRAS DE ADN
PORTILLA, Daniela; MOYÓN, Jennifer; CHAMORRO, Susana; NAVARRO,
Juan Carlos; RAMÍREZ-IGLESIAS, José R.*
Introducción
Biomonitoreo de
ecosistemas
Cambios y alteraciones Microorganismos
en los ecosistemas bioindicadores
Diatomeas
(Mann et al., 2010)
Escala que muestra la
Biomonitoreo de calidad de un entorno
ecosistemas Índice biótico
mediante el tipo de
organismos presentes
Problema de Investigación
Es necesario conocer la
Identificación
biodiversidad de
morfológica de especies
diatomeas
Forma Tamaño Estructuras
(Guo et al., 2015)
(Visco et al., 2015)
Qué marcadores son los más
Problema de Investigación apropiados para la identificación
de diatomeas del Ecuador a nivel
de especie
Códigos de barras de
Identificación molecular
ADN
Región susceptible a mutaciones
Regiones conservadas
(Guo et al., 2015)
Códigos de barras más utilizados
Subunidad pequeña de
ARN ribosomal Espaciador interno
transcrito
18S ITS
Subunidad larga de ribulosa 1,5-
rbcL bifosfato
(Moro et al., 2009), (Rimet et al., 2016), (Behnke et al., 2004), (Moniz y Kaczmarska, 2010), (Zimmermann et al., 2011)
Justificación
Establecimiento
de relaciones
filogenéticas
confiables
Identificación
Ahorro de de especies en
tiempo cualquier etapa
de su desarrollo
Ventajas de la
identificación
molecular
Estandarización Diferenciación
simple de entre especies
protocolos similares
(Visco et al., 2015)
Objetivos
General Específicos
• Evaluar la utilidad de los códigos de • Obtener cultivos axénicos de las
barras, 18S, rbcL e ITS, para la diatomeas procedentes de diferentes
ecosistemas del Ecuador.
identificación de diatomeas existentes
en diferentes ecosistemas del • Amplificar mediante PCR las regiones
Ecuador. de códigos de barras en los cultivos
axénicos obtenidos.
• Realizar la identificación taxonómica
clásica y molecular de diatomeas
mediante el uso de herramientas de
bioinformática.
• Comparar la capacidad de identificación
taxonómica de los códigos de barras
empleados.
Materiales y Métodos
Obtención de muestras Cultivo
• Muestras obtenidas de • Medio WC
• Río Rumipamba • 0,9% agar
• Lagos del Antisana • +50% silicato
• Raspado del mucílago de • T ambiente
rocas y ramas • 3 000 luxes
• 12/12 fotoperiodo
• Aislamiento de
especies encontradas
Materiales y Métodos
Identificación Amplificación por PCR y Análisis filogenético
morfológica secuenciación • Cladogramas
• Microscopio óptico • 18S, ITS y rbcL • Programas bioinformáticos
• Microscopio electrónico • Electroforesis • MEGA 10
• Purificación • Modelo de sustitución
• Secuenciación Macrogen ® Maximum likelihood
• Kimura 2
• Matriz de distanciasResultados Aislamiento • Tres cultivos axénicos PCH00001 de Rumipamba, PCH00002 de Rumipamba y NP00001 de Antisana A B C Figura 1. Cultivos axénicos en medio WC y agar al 0,9%. A) Colonias de Especie PCH00001 de Rumipamba. B) Colonias de Especie PCH00002 de Rumipamba. C) Colonias de Especie NP00001 de Antisana.
Identificación taxonómica
Morfológica Molecular
Forma de las Forma de los Códigos de barras de ADN Amplificación por PCR
valvas ápices
Ubicación y forma
del rafe
Dimensiones
Presencia y Presencia y número Secuenciación Árboles filogenéticos
número de estrías de fíbulasIdentificación molecular
ITS amplificación con una
18s mayor capacidad de rbcL baja o nula temperatura inferior y
amplificación amplificación presencia de bandas de
diferentes tamaños
Figura 5. Electroforesis de los productos de amplificación por PCR de los cultivos axénicos.
18S (1-3). rbcL (4-6). ITS (7-9). Especie PCH00001 de Rumipamba (1, 4, 7). Especie PCH00002 de
Rumipamba (2, 5, 8). Especie NP00001 de Antisana (3, 6, 9). Control negativo 18s, rbcL e ITS (10-12).Identificación taxonómica morfológica
Especie PCH00001 de Rumipamba
Tabla 1. Características morfológicas de Nitzschia linearis según
(Agardh) W.Sm. 1853
Largo 60-150 µm
Ancho 4-6 µm
Estrías en 10 µm 35-38
Valvas Lineales a lineal-lanceoladas con lados
paralelos excepto cerca del centro que es
cóncavo
Ápices Redondeados y casi capitados
Rafe Colocado excéntricamente, con un nódulo
Figura 2. Cultivo axénico PCH00001
de Rumipamba. Vista valvar (1-3). central distintivo
Vista pleural (4). Largo: 102.5-104.9. Fíbulas Varían en tamaño y número de 11 a 14 en
Ancho: 8.7-8.9. Entre 7-9 fíbulas en 10 µm
10 um. Estrías ParalelasIdentificación morfológica
Tabla 4. Descripción Especie PCH00001 de Rumipamba SEM.
Especie PCH00001 de Largo 102.5-104.9 µm
Rumipamba Ancho
Valvas
8.7-8.9 µm
Linear- lanceoladas. Márgenes
paralelos ligeramente cóncavos.
Ápices Subrostrados prolongados
1 2 3
Área central Con un puente de fíbulas
alargadas
Estrías Paralelas, rectas, uniseriadas
con areolas rectangulares
Cloroplastos 2 parietales
Número de 7 en 2µm
estrías
Figura 13. Cultivo axénico PCH00001 de Rumipamba SEM. Número de 9 en 2µm
Vista valvar (1-3). Vista completa (1). Ápice subrostrado fíbulas
prolongado (2). Área central con puente de fíbulas Areolas 8 en 2µm
alargadas, y estrías paralelas, rectas, uniseriadas con
areolas rectangulares (3).Identificación taxonómica molecular 18s
Especie PCH00001 de Rumipamba
Figura 6 . Árbol filogenético Especie PCH00001 de Rumipamba región 18sIdentificación taxonómica molecular rbcL Especie PCH00001 de Rumipamba Figura 7. Árbol filogenético Especie PCH00001 de Rumipamba región rbcL
Identificación taxonómica molecular ITS Especie PCH00001 de Rumipamba Figura 8. Árbol filogenético Especie PCH00001 de Rumipamba región ITS
Identificación taxonómica morfológica
Especie PCH00002 de Rumipamba
Tabla 2. Características de Mayamaea atomus según Lange-Bertalot & Bonik 1976
Largo 5,5-16 µm
Ancho 3-6,5 µm
Estrías en 10 µm 16-36
Valvas Elípticas a lineal-elípticas con extremos
ampliamente redondeados
Área axial Estrecha a muy ancha
Figura 3. Cultivo axenico Área central Pequeña a moderadamente grande,
PCH00002 de Rumipamba. redondeada o más o menos
Vista valvar (1-3). Vista pleural (4). transapicalmente ensanchada
Largo:10,8-12,8. Ancho 4,9-6,9.
Rafe Filiforme que se encuentra en una
Estrías invisibles.
nervadura mediana
Estrías Variables en inclinación radial continua a
radial muy fuerte, en el medio más o
menos la misma longitud que el resto o
individual más o menos acortadaIdentificación morfológica Tabla 5. Descripción Especie PCH00002 de Rumipamba SEM.
Especie PCH00001 Largo 10,8-12,8 µm
Ancho 4,9-6,9 µm
de Rumipamba Valvas Ovaladas
Ápices Ampliamente redondos.
1 2 3 Área central Circular
Área axial Estrecha- lanceolada
Estrías Uniseriadas, radiadas a lo largo de
la valva con areolas puntuadas.
Rafe Filiforme, recto con terminaciones
proximales desviadas para un lado
Figura 14. Cultivo axénico PCH00002 de Rumipamba SEM. de la valva, terminaciones distales
Vista valvar (1-3). Vista completa (1). Ápice ampliamente rectas
redondo y terminaciones distales rectas del rafe (2). Área Cloroplastos 2 parietales
central circular, área axial estrecha-lanceolada, parte del rafe
con terminaciones proximales desviadas para un lado de la Número de 7 en 2µm
valva (3). estrías
Areolas 7 en 2µmIdentificación taxonómica molecular 18s Especie PCH00002 de Rumipamba Figura 9. Árbol filogenético Especie PCH00002 de Rumipamba región 18s
Identificación taxonómica molecular rbcL Especie PCH00002 de Rumipamba Figura 10. Árbol filogenético Especie PCH00002 de Rumipamba región rbcL
Identificación taxonómica morfológica
Especie NP00001 de Antisana
Tabla 3. Características de Nitzschia perminuta según (Grunow in
Van Heurck) H.Perag. 1903
Largo 8-20 µm
Ancho 3-4 µm
Estrías en 10 µm 22-27
Fíbulas en 10 µm 11-13
Valvas Lineales a lineal-lanceoladas, con
márgenes paralelos. La valva distal se
Figura 4. Cultivo axénico estrecha abruptamente para formar
NP00001 de Antisana.
ápices ligeramente alargados a
Vista valvar (1-3).
Largo: 22,8-24,6. Ancho: 5,3-5,1. redondeados.
9 fíbulas en 10um. Estrías Paralelas y finamente punteadas.Identificación morfológica
Especie NP00001 de Tabla 6. Descripción NP00001 de Antisana SEM.
Largo 22,8-24,6 µm
Antisana Ancho 5,3-5,1 µm
Valvas Linear-lanceoladas con márgenes
paralelos
1 2 3 Ápices Prolongados rostrados
Estrías Rectas, paralelas, uniseriadas
formadas por areolas ovaladas.
Fíbulas Dispuestas de 2 en 2 puntuadas.
Cloroplastos 2 cloroplastos, 2 pirenoides
Número de 5 en 1µm
Figura 15. Cultivo axénico NP00001 de Antisana SEM. Vista estrías
valvar (1-3). Vista completa (1). Ápice prolongado rostrado Número de 9 en 1µm
(2). Estrías rectas, paralelas, uniseriadas formadas por
fíbulas
areolas ovaladas (3).
Areolas 5 en 1µmIdentificación taxonómica molecular 18s Especie NP00001 de Antisana Figura 11. Árbol filogenético Especie NP00001 de Antisana región 18s
Identificación taxonómica molecular ITS Especie NP00001 de Antisana Figura 12. Árbol filogenético Especie NP00001 de Antisana región ITS
Código de barras 18s rbcL ITS
Amplificación Amplificación En ocasiones baja Presente con
presente (Especie (PCH00002) o nula gradiente de
PCH0001 y 2 de RP y (NP00001) con temperatura (para las
NP00001 de Antisana) gradiente de 3 especies)
temperatura
Bases de datos Se encontró Se encontró No se encontró
GenBank de NCBI información sobre información sobre información sobre
especies relacionadas especies relacionadas especies relacionadas
Divergencia intra e Menor divergencia Mayor que 18s Mayor que 18s y rbcL
interespecífica
Consenso con la Si Si No aplica (limitación
identificación de las bases de datos)
morfológicaConclusiones
Las especies fueron correctamente identificadas
morfológica y molecularmente con 18s y rbcL
Se determina a la región v4 de 18s establecida por
Zimmerman como la mejor opción de código de barras
para la identificación de diatomeas del Ecuador
Existen diferencias entre ambos tipos de identificación lo
cual es un problema que se debe resolverImportancia
Establecer un Biomonitoreo
código de NGS frecuente y
Conocer la barras que Secuenciación confiable
biodiversidad identifique de de Nueva Tratamiento y
forma precisa Generación uso adecuado
a las del agua
diatomeas del
Ecuador
Completar las
bases de datosBibliografía • Moniz, M. B. J., & Kaczmarska, I. (2010). Barcoding of Diatoms: Nuclear Encoded ITS Revisited. Protist, 161(1), 7–34. https://doi.org/10.1016/j.protis.2009.07.001 • Moro, C. V., Crouzet, O., Rasconi, S., Thouvenot, A., Coffe, G., Batisson, I., & Bohatier, J. (2009). New design strategy for development of specific primer sets for PCR-based detection of Chlorophyceae and Bacillariophyceae in environmental samples. Applied and Environmental Microbiology, 75(17), 5729– 5733. https://doi.org/10.1128/AEM.00509-09 • Vasselon, V., Rimet, F., Tapolczai, K., & Bouchez, A. (2017). Assessing ecological status with diatoms DNA metabarcoding: Scaling-up on a WFD monitoring network (Mayotte island, France). Ecological Indicators, 82(June), 1–12. https://doi.org/10.1016/j.ecolind.2017.06.024 • Visco, J. A., Apothéloz-Perret-Gentil, L., Cordonier, A., Esling, P., Pillet, L., & Pawlowski, J. (2015). Environmental Monitoring: Inferring the Diatom Index from Next-Generation Sequencing Data. Environmental Science and Technology, 49(13), 7597–7605. https://doi.org/10.1021/es506158m • Zimmermann, J., Jahn, R., & Gemeinholzer, B. (2011). Barcoding diatoms: Evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Organisms Diversity and Evolution, 11(3), 173–192. https://doi.org/10.1007/s13127-011-0050-6
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