MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN DE RNA BASADO EN EL USO NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS - Dra. Capriotti Natalia
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11/PRPM
MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN DE
RNA BASADO EN EL USO
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS
Dra. Capriotti Natalia
nataliacapriotti@conicet.gov.ar
Centro Regional de Estudios Genómicos
11/PRPM
Instituto de Física de La Plata Centro Regional de Estudios Genómicos
(IFLP) (CREG)
Claudia Rodríguez Torres Sheila Ons Laboratorio de Salud Pública
(torres@fisica.unlp.edu.ar) Lucila Traverso Instituto Biológico
Natalia Capriotti Hospital Rossi
Fabiana Cabrera
Silvana Stewart
Pedro Mendoza Zeliz Instituto De Biotecnología Y Biología
Elisa De Sousa Molecular (IBBM) Convenio Agosto 2020 – PBA
Luciana Juncal - Ministerio de Producción,
Odín Vázquez Robaina Victor Romanowski Ciencia e Innovación
Matías Pidre Tecnológica.
Leticia Ferrelli - Ministerio de Salud.
Instituto de Investigaciones Florencia López
Fisicoquímicas Teóricas y Leslie Amorós
Aplicadas (INIFTA)
Patricia Schilardi
Carolina Diaz
Diego E. Pissinis
11/PRPM
Muestra Extracción de Amplificación
Generación de
Biológica RNA por PCR
cDNA
Detección
> cc. RNA < Ct
11/PRPM
Métodos de extracción de RNA
Solventes orgánicos Fase sólida (columnas Si02)
• Residuos • Propensión a obstruirse
• Procesamiento laborioso y manual intensivo • Retención de ácidos nucleicos grandes como el ADNg
• Difícil de automatizar • Necesidad de equipamiento costoso (centrifugas)
• Difícil de automatizar
11/PRPM
El objetivo del trabajo es proporcionar un protocolo de extracción de RNA
basado en perlas magnéticas de sílice de bajo costo, independiente de
equipamiento sofisticado y de producción nacional.
11/PRPM Antecedentes
11/PRPM
- Se obtuvieron nanopartículas de magnetita
(NPM, Fe3O4) por el método de co-precipitación
(IFLP)
- Se recubrieron con sílice (SiO2) por hidrólisis de
tetraetilortosilicato (TEOS) obteniéndose así las
“perlas magnéticas” (PEM)
(INIFTA)
Gentileza Y-TEC
11/PRPM
Desarrollo y optimización de un protocolo de extracción (CREG-IBBM)
LISIS DE
RNA LIGADO A LAS PEM LAVADOS ELUCIÓN
LA
MUESTRA
Buffer de Lisis: GITC + Triton
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(CREG)
• Muestra biológica: tejido blando de Rhodnius prolixus (3 replicas)
• Síntesis de cDNA: protocolo MML-V (Promega)
• RT-qPCR: Sybr Green y gen de referencia Rhopr_Actina
Método de Dilución 1:2 Dilución 1:4 Dilución 1:8
extracción RNA
Trizol Reagent 19,40 21,5 26,34
Protocolo PEM 17,80 20,01 21,22
+ centrifuga
Protocolo PEM 21,69 23,46 24,08
11/PRPM
Resultados
• Muestra biológica: línea celular pulmón A549. Concentración 105
• Molde RNA - dilución 1/5 (IBBM-CREG)
• RT-qPCR: Kit MGI
1 2 3
PEM 03720 15,03 15,97 16,28
PEM 23720 15,34 15,99 15,94
PEM 24720 14,95 16,2 16,44
Columnas GeneAid 14,72
1. 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,5
2. 4M GITC, 4% TritónX100 y pH6,5
3. 2M GITC, 4% TritónX100 y pH6,511/PRPM
Resultados
• Muestra biológica: hisopado bucal del operador (X 2)
• Molde RNA (CREG)
• RT-qPCR: Kit BGI
H 23 H 24
PEM 23720 21,96 -----
PEM 24720 ----- 21,65
Columnas GeneAid 21,53
Buffer 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,511/PRPM
Resultados
• Muestra biológica: oro y naso faríngeo sospechados de COVID Laboratorio Salud Pública
• Molde RNA (Exactas-UNLP)
• DETECTABLE una muestra si se detecta el gen ORFab
Número de muestras procesadas por ambos métodos: 46.
Número de muestras DETECTABLE según columnas: 15
Número de muestras DETECTABLE según PEM-UNLP: 13 (criterio Ct11/PRPM
Conclusiones
• Las PEM funcionalizadas con SiO2 son eficientes en la extracción de RNA. Se obtienen
resultados comparables con los obtenidos con los métodos comerciales disponibles.
• El protocolo resulta útil para la extracción de RNA en distintos tipos de muestras
biológicas.
• El protocolo depende en gran medida del buffer GITC/Tritón. Variaciones en las
concentraciones, pH podrían aumentar el rendimiento y eficiencia del método.11/PRPM Muchas gracias
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