MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS Y ADN - Serie de Normas Técnicas N 38 Lima 2003
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS Y ADN
CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTEÍNAS Y ADN
Serie de Normas
Técnicas N° 38
Serie de Normas Técnicas N° 39
Lima - 2003
CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTEÍNAS Y ADN
Serie de Normas
Técnicas N° 38
Lima - 2003
MINISTERIO DE SALUD Subcomité Editor
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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública
Volumen 19 Número 4 octubre – diciembre 2002
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publicación trimestral del Instituto Nacional de Salud que estimula la
divulgación de trabajos teóricos o aportes prácticos desarrollados por
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e-mail: artesydisenoslaser@hotmail.com E-mail: llecca@ins.gob.pe
MPR-CNSP-016 Instituto Nacional de Salud
Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS
PARA PROTEÍNAS Y ADN
ELABORACIÓN:
Blgo. Carlos Augusto Yábar Varas
División de Biología Molecular
Centro Nacional de Salud Pública
Instituto Nacional de Salud
Lima-Perú
MPR-CNSP-016 I Instituto Nacional de Salud
Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
AGRADECIMIENTO:
Blgo. Roger Calderón Espinoza
Blgo. Carlos Padilla Rojas
Blgo. Christian Baldeviano Vidalón
Blgo. Omar Cáceres Rey
Blga. Gisely Hijar Guerra
Blga. Elizabeth Sánchez Romaní
División de Biología Molecular
Centro Nacional de Salud Pública
Instituto Nacional de Salud
Catalogación hecha por el Centro de Documentación e Información del INS
Yábar Varas, Carlos.
Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN / Elaborado por
Carlos Yábar Varas. — Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud,
2003.
59 p. : 30 cm. — (Serie de Normas Técnicas; 38)
1. PROTEINAS /aislamiento y purificación 2. ADN /aislamiento y purificación
3. ELECTROFORESIS
I. Yábar Varas, Carlos
II. Instituto Nacional de Salud (Perú)
III. Perú. Ministerio de Salud
ISBN 9972 – 857 – 26 – 3 (O.C.)
ISBN 9972 – 857 – 38 – 7 (N°38)
ISSN 1607 – 4904
Hecho el Depósito Legal Nº 1501152003-4205
©Ministerio de Salud, 2003
Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, Perú
Telf.: 431-0410
©Instituto Nacional de Salud, 2003
Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú
Telf.: 471-9920 Fax 471-0179
e-mail: postmaster@ins.gob.pe
Página Web: www.ins.gob.pe
Publicación aprobada con R.J. Nº 460-2003-J-OPD/INS
Se autoriza su reproducción total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
MPR-CNSP-016 II Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ V
SECCIÓN 1: GENERALIDADES 1
1.1 Objetivo ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1
1.2 Campo de aplicación ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1
1.3 Abreviaturas y definiciones ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1
SECCIÓN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 3
SECCIÓN 3: MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 5
SECCIÓN 4: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○7
4.1 Objetivo ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
7
4.2 Materiales ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○7
4.3 Ensamblaje de la cámara de electroforesis ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○7
4.4 Preparación de geles de poliacrilamida ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○8
4.5 Preparación del gel de resolución ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 11
4.6 Preparación del gel de empacamiento ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
12
4.7 Preparación de la muestra biológica ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
12
4.8 Electroforesis ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 13
4.9 Coloración y visualización de las proteínas usando azul brillante de coomasie ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 16
4.10 Interpretación de resultados ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 17
4.11 Factores que afectan la migración de las proteínas ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
19
SECCIÓN 5: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 21
5.1 Objetivo general ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 21
5.2 Electroforesis vertical ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
21
5.3 Electroforesis de ADN en geles de poliacrilamida ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 22
5.4 Preparación de geles de agarosa para ADN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 25
5.5 Electroforesis de ADN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 27
5.6 Coloración y visualización de ADN en geles de poliacrilamida y agarosa usando
bromuro de etidio ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
28
5.7 Coloración y visualización de ADN en geles de poliacrilamida con nitrato de plata ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 30
5.8 Factores que afectan la migración del ADN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 32
SECCIÓN 6: VARIANTES DE ELECTROFORESIS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
35
6.1 Electroforesis bidimensional ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 35
6.2 Electroforesis de capilaridad ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 35
6.3 Electroforesis en campo pulsado (PFEG) ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 36
SECCIÓN 7: VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD ÓPTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS
EMPLEADOS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
37
7.1 Generalidades ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 37
7.2 Buffer para electroforesis de proteínas y ADN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 37
7.3 Persulfato de amonio ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 37
MPR-CNSP-016 III Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
7.4 Bromuro de etidio ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 37
7.5 Agarosa ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 38
7.6 Poliacrilamida al 30% ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
38
7.7 Agua destilada ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 38
7.8 Equipos de laboratorio ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
38
SECCIÓN 8: REGISTROS Y ARCHIVOS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
39
BIBLIOGRAFÍA ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
41
ANEXOS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
43
ANEXO A: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Y
ELECTROFORESIS DE ADN ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
43
ANEXO B: UNIDADES Y FÓRMULAS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 49
ANEXO C: MEDIDAS A TOMARSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON
REACTIVOS TÓXICOS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 51
ANEXO D: PROBLEMAS MÁS COMUNES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE
ELECTROFORESIS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 53
ANEXO E: EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 55
ANEXO F: PÁGINAS WEB RECOMENDADAS ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
59
MPR-CNSP-016 IV Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
INTRODUCCIÓN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas.
Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a
observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento.
El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de
matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño
o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de
fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de
las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.
En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin
embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la
electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentan
ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las
proteínas etc.
Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e hibridación, brinda
una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína, entre otros.
El presente manual de procedimientos es la recopilación de protocolos actualizados por los investigadores de la
División de Biología Molecular del Instituto Nacional de Salud. En este material se incluye, además de los
procedimientos técnicos de la electroforesis, un anexo indicando el modo de preparación de soluciones de
electroforesis, unidades y fórmulas básicas a ser aplicadas y algunas importantes medidas de bioseguridad que
deben considerarse durante la manipulación de los reactivos.
MPR-CNSP-016 V Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
SECCIÓN 1
GENERALIDADES
1.1 OBJETIVO
Establecer los procedimientos de la técnica de electroforesis de ADN y proteínas para ser difundidas
en la red de laboratorios.
1.2 CAMPO DE APLICACIÓN
Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen análisis y determinación de ADN y proteínas en
general.
1.3 ABREVIATURAS Y DEFINICIONES
1.3.1 ADN: ácido desoxirribonucleico.
1.3.2 ARN: ácido ribonucleico.
1.3.3 kDa: kilodaltons.
1.3.4 nM: nanomolar.
1.3.5 OD: densidad óptica.
1.3.6 pb: pares de bases.
1.3.7 PCR: reacción en cadena de polimerasa (Polimerase chain reaction).
1.3.8 pg: picogramo.
1.3.9 rpm: revoluciones por minuto.
1.3.10 µL: microlitro.
1.3.11 µM: micromolar.
1.3.12 ácido desoxirribonucleico: molécula compuesta de un anillo de desoxiribosa, una base nitrogenada
y un grupo fosfato que en su conjunto forman una estructura de doble hebra tipo helicoidal. Constituye
el material genético de todo tipo de células y virus de ADN, y tiene como función transmitir la información
genética de una generación a otra.
1.3.13 ácido ribonucleico: molécula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupo
fosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimático a nivel de ADN y durante la síntesis de
proteínas.
1.3.14 aminoácido: pequeñas moléculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en su
conjunto forman la estructura de las proteínas.
1.3.15 anfoterismo: propiedad de las proteínas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga,
dependiendo del pH y su punto isoléctrico (pI).
MPR-CNSP-016 1 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
1.3.16 densidad óptica: unidad de medida de absorción de la luz, definido como el logaritmo de la intensidad
de luz de entrada entre la intensidad de luz de salida.
1.3.17 desnaturalización de proteínas: pérdida de las estructuras nativas (secundaria, terciaria y
cuarternaria) de una proteína, adoptando la estructura primaria únicamente.
1.3.18 electroforesis: técnica utilizada para separar partículas coloidales tales como proteínas o ácidos
nucléicos a través una matriz sólida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamaño y
carga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).
1.3.19 enfoque isoeléctrico: técnica en gradiente de pH montada entre un ánodo y un cátodo, de donde
éste último tiene un pH más alto que el primero.
1.3.20 estructura cuaternaria: se refiere a la estructura tridimensional compleja adoptada por la proteína
compuesta de varios monómeros o polipéptidos.
1.3.21 estructura primaria de proteínas: se refiere a la estructura lineal formada por la unión secuencial
de aminoácidos.
1.3.22 estructura secundaria de proteínas: se refiere a la estructura bidimensional formada por el
plegamiento de la estructura primaria estabilizada por interacciones débiles.
1.3.23 estructura terciaria de proteínas: se refiere a la estructura tridimensional adoptada por la proteína
estabilizada por enlaces covalentes y no covalentes.
1.3.24 grado biología molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos como
nucleasas, proteasas o pirógenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebas
moleculares.
1.3.25 kilodalton: unidad de medida referente al peso molecular de las proteínas en general.
1.3.26 marcador estándar de peso molecular: fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizados
para determinar el tamaño de una molécula de ADN de interés por comparación después de una
electroforesis.
1.3.27 pares de bases: cada par de nucleótidos complementarios que en conjunto forman una doble hebra
de ADN.
1.3.28 PCR: polimerase chain reaction o reacción en cadena de la polimerasa; reacción enzimática in vitro
por el cual mediante múltiples ciclos de denaturación, alineamiento y extensión se sintetizan grandes
cantidades de una región genética específica.
1.3.29 plásmido: moléculas de ADN circular que se encuentran en la mayoría de bacterias y otros organismos
procariontes y que pueden llevar información genética para el organismo que lo alberga.
1.3.30 polimerización: acción química por el cual las moléculas de acrilamida y bisacrilamida forman un
entramado a manera de malla por la acción de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustancia
gelatinosa.
1.3.31 producto de amplificación: Moléculas de ADN sintetizadas en múltiples copias in vitro a partir de
ADN molde mediante el uso de PCR.
MPR-CNSP-016 2 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
SECCIÓN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
2.1 Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la característica
de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por lo tanto el
investigador siempre deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un
contacto directo o accidental con ellos (Ver más adelante lista de estos reactivos).
2.2 La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8W
de potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deberá contar
con una lámina de policarbonato transparente ubicada entre la lámpara y el punto de observación.
Además, deberá usar lentes de protección contra rayos UV del mismo material.
2.3 El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga eléctrica. Aunque
la mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar el contacto directo con la
electricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada al
momento de manipular el equipo.
2.4 El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse con extremo
cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes
a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.
MPR-CNSP-016 3 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN MPR-CNSP-016 4 Instituto Nacional de Salud
Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
SECCIÓN 3
MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
3.1 El investigador deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con ADN y proteínas.
Este paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por acción de las nucleasas o proteasas
presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitará que el laboratorista se
exponga ante algún posible riesgo de intoxicación por material infeccioso.
3.2 El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genómico y los productos
de amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el ADN plasmídico a - 20°C. Las
proteínas deben ser conservadas a -80°C o en su defecto a -20°C. Todas las muestras biológicas
deben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes pequeños para evitar etapas de descongelamiento
o congelamiento drásticos que ocasionarían un eventual deterioro de las moléculas.
3.3 Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de electroforesis,
se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000
µl, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio, cuenten con un
certificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650).
3.4 Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con
las moléculas de ADN sean nuevas y estériles, a fin de evitar una posible contaminación de la muestra
con nucleasas. Es importante señalar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre
y cuando estén libres de restos orgánicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121°C
a 1,5 psi). Con respecto a la manipulación de las proteínas, no se exige el uso de puntas nuevas
pero sí se recomienda esterilizarlas previamente.
3.5 Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten
con un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN
12650).
3.6 Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y proteínas
deben tener grado "biología molecular" para asegurar el éxito del procedimiento. El uso combinado
de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.
MPR-CNSP-016 5 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN MPR-CNSP-016 6 Instituto Nacional de Salud
Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
SECCIÓN 4
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
4.1 OBJETIVO
Realizar el proceso de electroforesis vertical discontinua denaturante de proteínas.
4.2 MATERIALES
4.2.1 Cámara de electroforesis vertical y accesorios.
4.2.2 Micropipetas de 20, 200 y 1000 µL.
4.2.3 Vaso de precipitación de 500 mL de capacidad.
4.2.4 Flotadores para microtubos de 1,5 mL.
4.2.5 Lámina extensible de parafina.
4.2.6 Gradillas de plástico.
4.2.7 Puntas descartables de polipropileno con capacidad para 20, 200 y 1000 µL.
4.2.8 Solución de poliacrilamida al 30% (Anexo A).
4.2.9 Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 (Anexo A).
4.2.10 Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8 (Anexo A).
4.2.11 Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% (Anexo A).
4.2.12 Persulfato de amonio (APS) al 10% recién preparado (Anexo A).
4.2.13 N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solución stock).
4.2.14 Agua bidestilada.
4.2.15 Buffer de resolución Tris-Glicina (Anexo A).
4.2.16 Butanol-agua (Anexo A).
4.3 ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA DE ELECTROFORÉSIS
4.3.1 El procedimiento para el ensamblaje de la cámara de electroforesis varía de acuerdo al modelo del
equipo, en consecuencia el investigador deberá seguir las instrucciones que recomienda el fabricante.
4.3.2 Debido a que la mayoría de las cámaras de electroforesis parten del mismo principio técnico, hemos
representado gráficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje de este
equipo (Figuras N° 1-4).
MPR-CNSP-016 7 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.3.3 En general, una cámara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:
4.3.3.1 Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la
altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamaño de los
vidrios es variable, dependiendo de la dimensión de la cámara.
4.3.3.2 Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexible
pero resistente (generalmente poliestireno o teflón). La función de los espaciadores es determinar el
grosor del gel.
4.3.3.3 Un peine, cuyos dientes pueden variar en número, tamaño y grosor. Tiene el mismo grosor de los
espaciadores y está confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se
colocarán las muestras
4.3.3.4 Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores,
a través de unas serie de prensas que ejercen presión y mantiene fijo todo el sistema
4.3.3.5 El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos
sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser
conectados. En otras cámaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el
investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis.
4.3.3.6 Fuente de poder: aparato que tiene por función proveer de energía eléctrica a la cámara de
electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidades
del investigador.
Es importante señalar que la cámara de electroforesis ya ensamblada deberá estar ubicada sobre
una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se
vierte la solución del gel dentro de la cámara, ya que se evita el derrame de la solución y la generación
de matriz desnivelada. Esta última podría generar la distorsión del perfil de las bandas de las proteínas
al final de la electroforesis.
4.4 PREPARACIÓN DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA
4.4.1 La electroforesis de proteínas descrito en este manual corresponde al sistema discontinuo denaturante.
Es discontinuo porque está conformado por dos geles de poliacrilamida de resolución y empacamiento
que presentan diferente concentración, composición y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero
limitados por una fase de separación visible al trasluz. Debido a que en estado líquido ambos geles
pueden mezclarse fácilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeración
del primero para continuar con la polimerización del otro. El gel de empacamiento generalmente se
localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarán las muestras. El
gel de resolución por su parte forma el cuerpo del gel por donde migrarán y se separarán las proteínas.
MPR-CNSP-016 8 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
Cátodo Anodo
Vidrio grande
Peine
Vidrio chico
Tanque de electroforesis
vertical
Espaciadores
Soporte Fuente de Poder
Voltímetros
Ganchos o prensas
Reguladores de
voltaje
Base de jebe
Electrodos Interruptor
Figura N° 1. Componentes de una cámara de electroforesis vertical
Peine
Peine
Espaciadores Área para el gel
1 - 5 cm de empacamiento
Vidrio
grande
Área para el gel
Vidrio chico
de resolución
Figura N° 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cámara de electroforesis vertical
MPR-CNSP-016 9 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
1. Ensamblar vidrios y espaciadores y colocar sobre un
soporte 4. Remover el butanol con agua y añadir gel
de empacamiento
Peine
Ganchos o
prensas
Soporte
Presión
Base de jebe
2. Añadir gel de resolución 5. Colocar peine y dejar polimerizar
Peine
3. Añadir butanol
Dejar gelificando
6. Retirar el peine. Colocar sobre mesa nivelada
Figura N° 3. Procedimiento para el ensamblaje de un modelo de cámara de electroforesis vertical.
MPR-CNSP-016 10 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
Cátodo Ánodo
Buffer de
electroforesis
Fuente de poder
Tanque de electroforesis
vertical
Figura N° 4. Sistema de electroforesis vertical ensamblado
4.5 PREPARACIÓN DEL GEL DE RESOLUCIÓN
4.5.1 Fundamento teórico
El gel de resolución es la matriz de poliacrilamida donde las moléculas de ADN o proteínas, van a
migrar generando un perfil de bandas o patrón electroforético. Dicho patrón varía de acuerdo al peso
molecular de cada una de las moléculas y a la concentración del gel mismo.
4.5.2 Procedimiento
4.5.2.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones.
4.5.2.2 Marcar el límite hasta donde la matriz de acrilamida será vertida, trazando una línea horizontal en el
vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicación exacta de la línea, colocar el peine entre
ambos vidrios y medir entre uno y cinco centímetros (dependiendo del tamaño de la cámara) por
debajo de los dientes del peine (Figura N° 2)
4.5.2.3 Realizar la preparación del gel de resolución a una concentración de acuerdo a las necesidades,
mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.
4.5.2.4 Aproximadamente 5 mL de solución deberán ser preparados en caso de trabajar con geles pequeños
de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La
concentración de poliacrilamida a usar dependerá de las necesidades del operador.
4.5.2.5 Una vez finalizada la preparación de la solución, añadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno,
tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.
MPR-CNSP-016 11 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.5.2.6 Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la línea trazada.
Posteriormente, añadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 µL) sobre la solución de
poliacrilamida para evitar el ingreso de moléculas de oxígeno que retarden la polimerización.
4.5.2.7 Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerización
la solución de poliacrilamida remanente.
4.5.2.8 Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con
agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol.
4.6 PREPARACIÓN DEL GEL DE EMPACAMIENTO
4.6.1 Fundamento teórico
El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como característica retener a las
proteínas manteniéndolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolución. Este proceso
permite mejorar la resolución de las proteínas en la electroforesis.
4.6.2 Procedimiento
4.6.2.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones.
4.6.2.2 Mezclar los componentes del gel (Anexo A).
4.6.2.3 Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solución.
4.6.2.4 Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cámara y sobre el gel de resolución ya polimerizado.
Inmediatamente después, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos
de poliacrilamida que lleguen a derramarse.
4.6.2.5 Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como control
de la polimerización la solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.
4.6.2.6 Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
4.7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA
4.7.1 Objetivo
Someter las muestras de proteínas a procesos químicos y físicos que permitan su óptimo
fraccionamiento en la electroforesis vertical.
4.7.2 Materiales
4.7.2.1 Micropipetas para volúmenes de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.
MPR-CNSP-016 12 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.7.2.2 Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 15 mL de capacidad.
4.7.2.3 Guantes.
4.7.2.4 Cocinilla de asbesto.
4.7.2.5 Vaso de precipitación de 500 mL.
4.7.2.6 Gradilla para tubos de 1,5 mL.
4.7.2.7 Buffer de la muestra (Anexo A).
4.7.2.8 Puntas de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.
4.7.3 Principio del procedimiento
La preparación de la proteína consiste en un proceso fisico-químico, en el cual se rompen enlaces
peptídicos y puentes disulfuro gracias a la acción de detergentes iónicos, reactivos reductores y altas
temperaturas, los que en conjunto consiguen desnaturalizar la proteína hasta su estructura
primaria.
4.7.4 Procedimiento
4.7.4.1 Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporción 3:1
(tres partes de la muestra y una de buffer).
4.7.4.2 Asegurar la tapa de los tubos con lámina extensible de parafina y someter la muestra a una temperatura
de 100° C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos dentro
de un recipiente o vaso de precipitación con agua hirviendo.
4.7.4.3 Controlar la temperatura con un termómetro adecuado.
4.7.4.4 Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitación y centrifugarlos por diez segundos
a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta
el proceso de electroforesis.
4.8 ELECTROFORESIS
4.8.1 Objetivo
Fraccionar las proteínas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando un
campo eléctrico.
4.8.2 Materiales
4.8.2.1 Micropipetas para volúmenes de 20 µL.
4.8.2.2 Cámara de electroforesis vertical y accesorios.
MPR-CNSP-016 13 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.8.2.3 Fuente de poder.
4.8.2.4 Buffer de electroforesis para proteínas (Anexo A).
4.8.2.5 Guantes.
4.8.2.6 Gradilla para tubos de 1,5 mL.
4.8.2.7 Puntas para micropipeta de 20 µL.
4.8.2.8 Envase con lejía al 10% para descarte de puntas.
4.8.3 Principio del procedimiento
En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las proteínas a analizar, de acuerdo a
su peso molecular. Dicha distribución dependerá de la concentración del gel de resolución con el
que se esté trabajando.
4.8.4 Procedimiento
4.8.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradación de las moléculas por
la acción de las proteasas presentes en la mano.
4.8.4.2 Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo buffer de
electroforesis o de resolución para proteínas 1X. Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo y
otro negativo (frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente) que serán
conectados a una fuente poder (Figuras N° 1 y 5). Al momento de sumergir los geles en el tanque,
asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.
4.8.4.3 Mediante el uso de puntas de hasta 20 µL y 30 µL de capacidad proceder a depositar cuidadosamente
la muestra en los pocillos evitando la contaminación del pocillo contiguo.
4.8.4.4 Considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de la
muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la proteína, excepto cuando
se trate de un marcador previamente teñido en que el que se obviará el uso del buffer de la
muestra.
4.8.4.5 Una vez finalizada la colocación de las proteínas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapa
y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
4.8.4.6 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje correspondientes.
4.8.4.7 Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel desde la parte
superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitirá
determinar el voltaje total. El voltaje óptimo dependerá de la naturaleza de la molécula de ADN que
se piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
4.8.4.8 El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) dependerá de la
fuerza iónica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-Glicina 1X (Ver solución stock, Anexo A),
el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.
MPR-CNSP-016 14 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.8.4.9 Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una línea azul por el colorante
del buffer) haya llegado a los límites de la parte inferior del gel.
4.8.4.10 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de
poliacrilamida.
4.8.4.11 Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separación de
los vidrios que contienen el gel.
4.8.4.12 Separar el gel de empacamiento del gel de resolución realizando un corte transversal.
4.8.4.13 Hacer una pequeña muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientación para
ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.
4.8.4.14 Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frágil
y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentración. Para
desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y
usar uno de los espaciadores a manera de espátula para levantarlo por una de las puntas. Coger el
gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul
brillante de coomasie.
4.8.4.15 El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo ser
reciclado hasta cinco veces, después de los cuales se deberá preparar una nueva solución dado que
puede afectar el tiempo de corrida de la prueba.
4.8.4.16 Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con abundante agua y detergentes
especiales que puedan ser fácilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada y
secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37°C.
CÁTODO ÁNODO
e- e-
e- e-
a
Buffer de
resolución
c Gel de
b d empacamiento
e
e- Gel de
e- resolución
Buffer de
resolución
e- e- e- e- e- e- e- e- e-
e-
Figura N° 5. Interior de una cámara de electroforesis vertical en operación: a) Durante la colocación de la muestra en el pocillo del
gel, b) Después de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las proteínas, c, d y e) las proteínas
migran hacia el ánodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.
(e-)= electrones
MPR-CNSP-016 15 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.9 COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS USANDO AZUL BRILLANTE DE
COOMASIE
4.9.1 Objetivo
Visualizar las proteínas en el gel de poliacrilamida.
4.9.2 Materiales
4.9.2.1 Frasco oscuro de 1 L para el colorante azul brillante de coomasie.
4.9.2.2 Recipiente para colorear el gel.
4.9.2.3 Solución de trabajo de azul brillante de coomasie R-250 (Anexo A).
4.9.2.4 Solución de decoloración rápida (Anexo A).
4.9.2.5 Solución de decoloración lenta (Anexo A).
4.9.2.6 Solución glicerol-metanol (Anexo A).
4.9.2.7 Agua destilada.
4.9.2.8 Guantes.
4.9.3 Principio del procedimiento
El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del enlace peptídico de las proteínas
sobre grupos de ácido sulfónico que son los que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzas
de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso de unión mecánica.
Este paso permite la visualización de proteínas en un rango de sensibilidad entre 0,5 µg y 2 µg.
4.9.4 Procedimiento
4.9.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algún tipo de contacto con los
reactivos.
4.9.4.2 Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o teflón, conteniendo solución de trabajo de
azul brillante de coomasie en un volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubando
con un suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es importante precisar que el tiempo de
incubación dependerá del grado de sensibilidad requerida en la prueba, de la concentración del gel y
de la sensibilidad del azul brillante de coomasie propiamente dicho. En ese sentido, una máxima
sensibilidad de coloración puede ser obtenida incubando por ejemplo un gel al 5% en 1 hora y un gel
al 10% por 2 horas.
4.9.4.3 Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenido
fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretinción que impediría la visualización de
las proteínas.
MPR-CNSP-016 16 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.9.4.4 Culminado el tiempo de incubación, depositar el colorante en su frasco original.
4.9.4.5 Cubrir el gel teñido con solución de decoloración rápida e incubar por 30 minutos. Eliminar la solución
decolorante rápida y añadir un segundo volumen de la misma solución hasta apreciar las primeras
bandas. Acto seguido, eliminar la solución de decoloración rápida y añadir la solución decolorante
lenta. Dejar destiñendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solución por
una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiñendo hasta que las bandas de las proteínas
puedan ser apreciadas claramente.
4.9.4.6 Finalizada la remoción del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Para
poder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vacío o
manualmente.
4.9.5 Secado manual de geles de poliacrilamida
4.9.5.1 Remojar el gel teñido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotación
suave.
4.9.5.2 Posteriormente, remojar una lámina de celofán de aproximadamente 15 x 15 cm en agua y colocarlo
encima de un bastidor cuyo tamaño dependerá del tamaño del gel. Seguidamente, colocar el gel
sobre el celofán y observar que no se formen burbujas.
4.9.5.3 Cubrir el gel con un segundo celofán previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo
"sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 días.
4.9.5.4 Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofán que contiene el gel.
4.9.5.5 Cortar y guardar el exceso de celofán.
Nota importante: el celofán debe ser hidrofílico y no plastificado
4.10 Interpretación de resultados
4.10.1 Las proteínas fijadas en geles de poliacrilamida y teñidas con azul brillante de coomasie se observan
como bandas azules de diferentes pesos moleculares.
4.10.2 El peso molecular de una proteína se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser
determinado comparando la banda con un patrón de proteínas estándar de peso conocido denominado
marcador de peso molecular.
4.10.3 La distribución de las proteínas depende de la concentración del gel, por lo tanto, el operador deberá
seleccionar el marcador de peso molecular más adecuado.
4.10.4 Algunas proteínas suelen migrar anómalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso del
esperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su
estructura como residuos de glicosilación, fosforilación y acetlización, las cuales podrían retardar la
migración de las muestras.
MPR-CNSP-016 17 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.10.5 Las proteínas degradadas (desnaturalización de las proteínas por causa de un agente químico
catalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces
suelen confundirse con proteínas de menor peso molecular (Figuras N° 6 y 7)
1 2 3 4 5 6 7
Figura N° 6. Electroforesis de proteínas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5:
concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 µg de proteína. Carriles 6 y 7: proteínas degradadas.
1 2 3 4 5
97,4 -
66 -
45 -
31 -
21,5 -
Figura N° 7. Electroforesis de proteínas purificadas (Carriles 2 y 4) y proteínas totales de Leishmania brazilensis.
MPR-CNSP-016 18 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
4.11 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Los principales factores que afectan la migración de las proteínas durante la electroforesis son las
siguientes:
4.11.1 Fuerza del campo eléctrico (E)
Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico. Su
unidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puede
ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial
eléctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional
(Fa) y de la carga neta de la molécula (Q). Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula:
E = Fa/Q
E= v/d
Donde:
Fa = Fuerza direccional.
v = voltios.
d = distancia de los electrodos (en centímetros)
Q = carga en (coulomb)
4.11.2 Temperatura
Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la concentración de sales (poder de
conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa"
o smiling (Figura Nº 8).
Figura Nº 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para proteínas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extraída de Internet.
(http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).
4.11.3 Carga neta de la molécula
La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada proteína
una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminoácidos. Debido
MPR-CNSP-016 19 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico, la migración
de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar
este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas aprovechando sus propiedades
anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de
favorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular.
4.11.4 Tamaño y forma de la molécula
4.11.4.1 Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante la
electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones
postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generan
modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento del
análisis.
4.11.4.2 Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioquímica de una proteína no caracterizada,
perviamente deberá estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el análisis
de la proteína por electroforesis.
MPR-CNSP-016 20 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
SECCIÓN 5
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN
5.1 OBJETIVO GENERAL
Conocer los procedimientos básicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN.
5.2 ELECTROFORESIS VERTICAL
5.2.1 Objetivo
Conocer el procedimiento técnico de la electroforesis vertical para ADN en geles de poliacrilamida.
5.2.2 Materiales
5.2.2.1 Cámara de electroforesis vertical y accesorios.
5.2.2.2 Micropipetas de 20 µ, 200 µL y 1 000 µL.
5.2.2.3 Lámina extensible de parafina.
5.2.2.4 Puntas de polipropileno con capacidad para 20 µ, 200 µ y 1 000 µl.
5.2.2.5 Buffer de resolución stock TBE 5X (Anexo A).
5.2.2.6 Buffer de resolución TBE 1X (Anexo A).
5.2.2.7 Poliacrilamida al 30%.
5.2.2.8 APS al 10%.
5.2.2.9 TEMED.
5.2.3 Ensamblaje de la cámara de electroforesis vertical
El modo de ensamblar una cámara de electroforesis vertical fue detallado en la sección 4.3. Sin
embargo, toda cámara de electroforesis vertical viene acompañada de una serie de especificaciones
técnicas de los fabricantes, en tal sentido recomendamos leer el manual del equipo.
5.2.4 Preparación del gel de resolución
5.2.4.1 El sistema de electroforesis vertical para ADN corresponde al sistema continuo no denaturante. Este
sistema, a diferencia de la electroforesis para proteínas, no utiliza un gel de empacamiento y los
componentes del gel de resolución son totalmente diferentes.
5.2.4.2 Procedimiento
a. Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones.
MPR-CNSP-016 21 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
b. No será necesario marcar el límite hasta donde será vertida la poliacrilamida, debido a que el gel
usado es continuo.
c. Realizar la preparación del gel siguiendo el orden que se indica en el Anexo A.
d. Aproximadamente 5 mL de la solución deberán ser preparado en caso de trabajar con geles pequeños
(aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). La
concentración de poliacrilamida para ADN dependerá de los objetivos de trabajo del operador.
e. Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen.
f. Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope.
Inmediatamente después, colocar el peine de teflón entre ambos vidrios secando con papel toalla los
restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.
g. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando como control
la solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.
h. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
5.3 ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA
5.3.1 Objetivo
Separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de poliacrilamida.
5.3.2 Materiales
5.3.2.1 Micropipetas para volúmenes de 20 µl.
5.3.2.2 Cámara de electroforesis.
5.3.2.3 Fuente de poder.
5.3.2.4 Poliacrilamida al 30%.
5.3.2.5 TEMED.
5.3.2.6 APS 10%.
5.3.2.7 Buffer de electroforesis para ADN TBE (Anexo A).
5.3.2.8 Buffer de la muestra para ADN (Anexo A).
5.3.2.9 Guantes.
5.3.2.10 Gradilla para tubos de 1,5 mL.
5.3.2.11 Puntas para micropipeta de 20 µl.
MPR-CNSP-016 22 Instituto Nacional de SaludManual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN
5.3.2.12 Envase para descarte de puntas.
5.3.3 Principio del procedimiento
En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las moléculas de ADN a analizar de
acuerdo a su peso molecular. Dicha distribución será afectada por la concentración del gel de resolución
que se esté trabajando.
5.3.4 Procedimiento
5.3.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las muestras, los reactivos y el equipo.
5.3.4.2 Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos
tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo
negativo que serán conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis
para ADN, en este caso el buffer TBE 1X (Figura N° 9). Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.
5.3.4.3 Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volúmenes de solución que contiene
el ácido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o buffer de
muestra 6X. Añadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alícuotas, de acuerdo al número
de muestras que se colocarán en los pocillos, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina
(Figura N° 10). Acto seguido, añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las
alícuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.
5.3.4.4 Mediante el uso de puntas de 20 µl proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos
evitando la contaminación del pocillo contiguo (Figura N° 9).
CÁTODO ÁNODO
e- e- Punta de la
e- micropipeta
e- depositando la
muestra en el pocillo
A
B C D E
Buffer de
resolución
Banda de ADN
e- Gel de resolución
e-
e- e- e- e- e- e- e- e- e-
e-
Figura N° 9. Interior de una cámara de electroforesis vertical para ADN en operación. A: Durante el depósito de la muestra de ADN
mezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicación del voltaje y migración del ADN a través del gel poliacrilamida. E: Las moléculas
de ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiñiendo el ADN con bromuro de
etidio y aplicando luz ultravioleta.
MPR-CNSP-016 23 Instituto Nacional de SaludTambién puede leer
