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P U E S TA AL DÍA
Genética y biología molecular en cardiología (VI)
Modelos animales genéticamente modificados
en investigación cardiovascular
Florence Dalloz, Hanna Osinska y Jeffrey Robbins
Department of Pediatrics. Division of Molecular Cardiovascular Biology. Children’s Hospital Research
Foundation. Cincinnati. OH-EE.UU.
Es un principio básico de la medicina clínica y molecu- Genetically Modified Animal Models
lar que la función de las células y los órganos se basa en in Cardiovascular Research
elementos proteicos específicos. Puesto que la función
de las células y en último término de los órganos depen- It is a basic tenet of molecular and clinical medicine that
de de los polipéptidos que se encuentran presentes, no specific protein complements underlie cell and organ
es sorprendente que cuando se altera la función se pro- function. Since cellular and ultimately organ function de-
duzcan cambios en el contenido de proteínas. En el co- pend upon the polypeptides that are present, it is not sur-
razón existen numerosos ejemplos en los que cambios prising that when function is altered changes in the pro-
en las proteínas contráctiles se correlacionan con altera- tein pools occur. In the heart, numerous examples of
ciones funcionales, tanto durante el desarrollo normal contractile protein changes correlate with functional alte-
como durante el desarrollo de numerosas patologías. De rations, both during normal development and during the
la misma manera, diversas enfermedades cardíacas development of numerous pathologies. Similarly, different
congénitas se caracterizan por determinados cambios en congenital heart diseases are characterized by certain
las proteínas motoras. Para comprender esta relación, y shifts in the motor proteins. To understand these rela-
para establecer modelos en los que los procesos pato- tionships, and to establish models in which the pathoge-
génicos puedan ser estudiados longitudinalmente, es ne- nic processes can be studied longitudinally, it is neces-
cesario dirigir el corazón para que sintetice de manera sary to direct the heart to stably synthesize, in the
estable la proteína candidata, en ausencia de otros cam- absence of other peliotropic changes, the candidate pro-
bios pleiotrópicos. Posteriormente, se puede determinar tein. Subsequently, one can determine if the protein’s pre-
si la presencia de la proteína causa directa o indirecta- sence causes the effects directly or indirectly with the
mente los efectos con el objetivo de definir potenciales goal being to define potential therapeutic targets. By af-
dianas terapéuticas. Mediante la manipulación controla- fecting the heart’s protein complement in a defined man-
da de la dotación proteica del corazón, se puede esta- ner, one has the means to establish both mechanism and
blecer el mecanismo y la función de diferentes proteínas the function of the different mutated proteins of protein
mutadas o isoformas proteicas. La reconstrucción génica isoforms. Gene targeting and transgenesis in the mouse
y la transgénesis en el ratón proporcionan herramientas provides a means to modify the mammalian genome and
para modificar el genoma de los mamíferos y la dotación the cardiac motor protein complement. By directing ex-
proteica motora del corazón. Dirigiendo la expresión de pression of an engineered protein to the heart, one is now
una proteína modificada por ingeniería genética directa- able to effectively remodel the cardiac protein profile and
mente al corazón, es posible remodelar de manera efec- study the consequences of a single genetic manipulation
tiva el perfil proteico cardíaco y estudiar las consecuen- at the molecular, biochemical, cytological and physiologic
cias de una única manipulación genética a nivel levels, both under normal and stress stimuli.
molecular, bioquímico, citológico y fisiológico, tanto en
condiciones normales como bajo estímulos de estrés.
Palabras clave: Modelos genéticos. Reconstrucción gé- Key words: Genetic models. Gene targeting. Transge-
nica. Transgénesis. Proteínas. Hipertrofia. Miocardiopa- nesis. Proteins. Hypertrophy. Cardiomyopathy. Basic re-
tía. Investigación básica. search.
(Rev Esp Cardiol 2001; 54: 764-789) (Rev Esp Cardiol 2001; 54: 764-789)
Sección patrocinada por el Laboratorio Dr. Esteve
INTRODUCCIÓN
Correspondencia: J. Robbins.
Division of Molecular Cardiovascular Biology
Children’s Hospital Research Foundation.
A pesar de los grandes avances que se han hecho en
Cincinnati, OH 45229-3039. EE.UU. cardiología, las enfermedades cardiovasculares siguen
Teléfono: 513-636-8098
Fax: 513-636-3852
siendo la principal causa de muerte y morbilidad en
Correo electrónico: jeff.robbins@chmcc.org las sociedades industriales. El siglo XX se ha caracteri-
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en investigación cardiovascular
zado por el rápido desarrollo de la tecnología médica, subyacen a la función de las células y de los órganos.
por la rápida expansión de la información relacionada A su vez, la producción proteica está controlada por
con la investigación y el desarrollo ideológico, y por la patrones de transcripción específicos para cada tipo
relativamente rápida incorporación de información celular y definidos por un conjunto común de genes.
nueva a la práctica. Los avances en los métodos de Puesto que la célula y, en último término, la función
diagnóstico y terapia en la cardiología clínica han con- de un órgano depende de los polipéptidos que están
ducido a un progreso real en el tratamiento y, en algu- presentes, no es sorprendente que cuando la función
nos casos, a una mejoría o incluso prevención de las está alterada, por ejemplo durante el desarrollo de una
enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, a pesar enfermedad, se produzcan también cambios en el con-
de la progresiva sofisticación de las técnicas, nuestra tenido proteico. En el corazón existen numerosos
capacidad para tratar las causas de las enfermedades ejemplos de cambios en las proteínas contráctiles que
cardiovasculares sigue siendo limitada. En otras pala- se correlacionan con alteraciones funcionales, tanto
bras, podemos tratar muchos de los síntomas, pero de- durante el desarrollo normal como durante el proceso
bido a la limitación en la comprensión de la etiología de desarrollo de numerosas patologías. De igual mane-
primaria que subyace al comienzo o desarrollo de un ra, varias enfermedades congénitas cardíacas se carac-
proceso patológico, las causas desencadenantes siguen terizan por determinados cambios en las proteínas mo-
sin poderse modificar por la práctica clínica. toras. Así por ejemplo, en la insuficiencia cardíaca se
Hasta muy recientemente, los enfoques que se han han documentado cambios en la cascada de regulación
utilizado para estudiar las enfermedades se han basado de diversos (hipotéticos) efectores/moduladores. Para
en herramientas farmacológicas, quirúrgicas, bioquí- entender todas estas relaciones y poder establecer mo-
micas o fisiológicas. Constituye una lección de humil- delos en los cuales los procesos patogénicos puedan
dad el darnos cuenta de que estamos tratando de des- ser estudiados de forma longitudinal, es necesario diri-
cribir sistemas fisiológicos complejos sin tener una gir el corazón para que sintetice de forma estable, en
comprensión o una apreciación completa de las identi- ausencia de otros cambios pleiotrópicos, la proteína
dades de las partes integrantes. Las estimaciones sobre candidata. De esta forma es posible determinar si la
el número de genes en el genoma de los mamíferos va- presencia de una proteína es responsable directa o in-
rían desde 50.000 a 100.000, pero hasta el momento directamente de los efectos estudiados, con el objetivo
sólo el 10% parecen tener algún tipo de utilidad. Así de definir las potenciales dianas terapéuticas. Al mani-
pues, es posible que estemos perdiendo aproximada- pular el contenido proteico del corazón de una deter-
mente un 90% de la información más básica necesaria minada manera, se dispone de un medio adecuado
para entender el rendimiento genético –una informa- para establecer tanto el mecanismo como la función de
ción que casi con seguridad está en la base de muchas diferentes proteínas mutadas o isoformas proteicas. La
de las enfermedades cardiovasculares, de manera di- transgénesis y la reconstrucción génica, y la subsi-
recta o indirecta, al determinar la respuesta del cora- guiente creación de modelos animales estables, pro-
zón a los estímulos ambientales. Mientras se escribe porcionan herramientas para modificar el genoma de
este trabajo de revisión, diversos comunicados han in- los mamíferos y estudiar las consecuencias que esto
formado sobre la finalización del proyecto genoma hu- pueda tener en el sistema cardiovascular. Utilizando la
mano. Durante los próximos 1-3 años podremos com- expresión dirigida al corazón de una determinada pro-
parar esta información con la obtenida sobre el teína modificada por ingeniería genética, se puede re-
genoma de otros mamíferos, tales como la rata y el ra- modelar de manera efectiva el perfil de proteínas car-
tón. Aunque estos datos aportan las bases estructurales díacas y también estudiar las consecuencias de una
para una comprensión profunda de la fisiología de los manipulación genética aislada a nivel molecular, bio-
mamíferos, tomados tal y como se obtienen pueden ser químico, citológico y fisiológico, tanto en condiciones
de muy poca ayuda para el clínico. Su valor va a de- normales como bajo estímulos de estrés.
pender en gran medida de la eficiencia con la que los Nuestra discusión se centrará en las miocardiopa-
científicos básicos sean capaces de extraer informa- tías, y en cómo los modelos obtenidos por ingeniería
ción de estas bases de datos. La utilización de los da- genética han sido utilizados de manera eficaz para
tos que se obtienen en su contexto biológico puede confirmar la etiología primaria y para explorar los pro-
conducir a un nuevo concepto de medicina. En su con- cesos patogénicos que finalmente conducen a una in-
junto, todos estos datos pueden, por una parte, revelar suficiencia cardíaca. Se analizarán las ventajas y los
la etiología genética primaria responsable del desarro- puntos débiles de la tecnología que se encuentra ac-
llo de las enfermedades y, por otra, proporcionar nue- tualmente disponible, así como la que está en proceso
vas estrategias de manejo en el tratamiento de las en- de desarrollo, y que tiene un futuro prometedor en este
fermedades cardiovasculares. campo. En lugar de ser una revisión de tipo enciclopé-
Si en los últimos 25 años la biología molecular nos dico, este trabajo se centrará en la manera en cómo los
ha enseñado algo acerca de la biología clínica es, pre- conceptos actuales se están aplicando a su objetivo,
cisamente, que los elementos proteicos específicos para que el desarrollo de futuras tecnologías, que in-
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evitablemente nos van a sorprender, puedan ser apre- los animales, la investigación básica se ha limitado
ciadas en su contexto. fundamentalmente al ratón y, en casos excepcionales,
al conejo2,3. El desarrollo de esta técnica, que consiste
en la inyección de ADN directamente en el embrión
CREACIÓN DE MODELOS ANIMALES
fertilizado, procede del desarrollo de técnicas relacio-
ESTABLES
nadas con los campos de la manipulación embrionaria
Existen varias técnicas disponibles hoy día que per- y el ADN recombinante4. La inserción de ADN exóge-
miten alterar el aparato contráctil del corazón de una no es un proceso que se produce al azar y numerosas
manera determinada: nos vamos a centrar en aquellos copias se insertan dentro del genoma, normalmente en
enfoques que resultan en una transmisión por la línea una disposición paralela o antiparalela. El investigador
germinal de los eventos de remodelado. De esta mane- no puede controlar el punto de inserción, ni tampoco
ra, las modificaciones deseadas pueden ser propagadas predeterminar el número de copias que se colocan en
a través de sucesivas generaciones y pueden resultar el genoma receptor. Las diversas fases de este proceso
en la creación de modelos animales nuevos y estables. se describen en la tabla 1. Así, a diferencia de la re-
Necesariamente estos cambios estables tienen que rea- construcción génica, en la cual la recombinación ho-
lizarse a nivel genético y con este objetivo se han de- móloga puede ser seleccionada (ver más adelante, en
sarrollado 2 aproximaciones distintas pero comple- la siguiente sección), la transgénesis es un fenómeno
mentarias: la transgénesis y la reconstrucción génica. que se produce al azar, y el ADN se sitúa en lugares
Cada una de ellas sirve para modificar el genoma de distintos a los que se encuentran las secuencias homó-
los mamíferos pero son muy diferentes entre sí, tanto logas. Esto conlleva que la expresión de los transgenes
en los aspectos técnicos como en su rendimiento gené- se superimponga a la expresión de los genes endóge-
tico. Mediante la transgénesis, el aparato contráctil del nos. Así, para que se manifieste un fenotipo, el trans-
corazón puede ser remodelado de manera significativa, gén tiene que producir un efecto dominante. La activi-
pero los resultados del método residen exclusivamente dad transcripcional final del ADN transgénico puede
en la capacidad de los transgenes para producir un fe- ser dependiente o independiente del número de copias,
notipo que se contraponga al contexto endógeno, ya y a menudo se encuentra influenciada por la localiza-
que los transgenes no afectan el rendimiento genético ción cromosómica particular en la cual está insertado
endógeno. De igual manera que la transgénesis, la re- («efecto posicional»), haciendo que sea más o menos
construcción génica (a menudo referida como ablación activo desde el punto de vista transcripcional. Además,
génica o eliminación génica) cambia de forma directa la inserción del ADN no es un proceso benigno y pue-
la estructura genética, y el aparato contráctil del cora- de producir una importante disrupción, reorganización
zón puede ser alterado drásticamente con esta técnica. o pérdida del ADN que lo flanquea, lo que da lugar a
La eliminación de un gen puede conducir a la pérdida efectos mutagénicos por inserción5. Afortunadamente
de una función, lo que permite establecer una secuen- estos efectos son mayoritariamente recesivos y, dado
cia posible responsable de esta función. La reconstruc- que los análisis de los animales transgénicos suelen es-
ción génica también puede usarse para producir cam- tar restringidos a los heterocigotos, esto no representa
bios en las secuencias que codifican un dominio un problema. Los efectos debidos al número de copias
funcional de una proteína contráctil, o cambios a nivel y a la posición requieren el análisis de múltiples lí-
de un único aminoácido, lo que permite establecer re- neas, lo que constituye un proceso costoso e intensivo.
laciones precisas entre estructura y función. Todas es- No obstante, se pueden generar múltiples mutaciones
tas aproximaciones experimentales, que se encuentran y constructos quiméricos y se han conseguido numero-
comparadas y contrastadas en la tabla 1, están dando sas líneas de ratones de forma relativamente rápida si
lugar a un grupo de animales en los que las alteracio- se compara con la técnica de reconstrucción génica.
nes en los elementos proteicos contráctiles conducen a Por todos estos aspectos se recomienda una considera-
una comprensión profunda de las relaciones entre es- ción cuidadosa sobre el tipo de enfoque transgénico
tructura y función que subyacen a la función cardíaca para los estudios de remodelado cardíaco.
a nivel molecular, bioquímico, orgánico y también a La expresión sistémica de un transgén puede com-
nivel del animal entero. plicar seriamente cualquier fenotipo cardíaco resultan-
te. El desarrollo de promotores o secuencias que con-
trolan y dirigen la expresión de los genes, y cuya
Transgénesis
expresión está fundamentalmente restringida al cora-
La transgénesis permite alterar de manera estable el zón, ha mejorado la utilidad del enfoque transgénico
genoma de los mamíferos de tal manera que las modi- para el estudio de las enfermedades cardiovasculares
ficaciones puedan ser transmitidas a través de la línea –en ausencia de efectos en otros órganos o tejidos
germinal. Aunque el procedimiento es técnicamente musculares que puedan inducir a la confusión. No es
posible en los animales grandes1, debido al coste eco- sorprendente que las propias secuencias transcripcio-
nómico, al tiempo y a consideraciones en el manejo de nales de los genes del aparato contráctil cardíaco ha-
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TABLA 1. Transgénesis y reconstrucción génica
Transgénesis Reconstrucción génica
Principio
Preparación del transgén Preparación del transgén
– Clonación del ADN de interés seleccionado: cADN o ADN – Clonación del ADN seleccionado de interés: ADN genómico con
genómico intrones y exones y extensas regiones de homología con el gen
– El vector contiene el constructo a insertar en el genoma endógeno de interés
huésped, compuesto de un promotor con especificidad celular – La preparación del vector puede ser de dos maneras:
o de tejido + ADN de interés + secuencia de poliadenilación vector de reemplazamiento = vector + ADN genómico de interés
– Antes de la microinyección el vector es liberado y sólo se cuya identidad ha sido destruida mediante inserción de un
inyecta el constructo marcador seleccionable en un exón crítico + marcadores de
– Purificación del ADN para microinyección selección o
vector de inserción = vector + segmento del ADN genómico
de interés + marcadores de selección
– Linealizar el vector, antes de su utilización
– Fuera de la secuencia homóloga seleccionada para el
reemplazamiento del vector
– Dentro de la secuencia homóloga para el vector de inserción
– Purificación del constructo para electroporación
Electroporación de células madre embrionarias (ESC) y selección
– Preparar ESC en cultivo
– Electroporar ESC con el vector de selección
– Retener los clones de ESC resistentes a las drogas
– Identificar mediante Southern o PCR un hecho que permita
la selección
Microinyección Microinyección
– Cruzar las donantes de óvulos con los machos – Cruzar las donantes de óvulos con los machos
– Recolectar los óvulos fertilizados – Recolectar los blastocitos
– Microinyectar el constructo en los huevos fertilizados – Microinyectar las ESC seleccionadas en los blastocitos
– Transferir los óvulos a hembras seudoembarazadas – Transferir el blastocito a una hembra seudoembarazada
– Hacer el genotipo de las crías para identificar los progenitores – Hacer genotipo de las crías quiméricas
Reproducción y análisis Reproducción y análisis
– Cruzar los progenitores transgénicos – Cruzar los ratones quiméricos
– Hacer el genotipo de la generación de crías F1 – Hacer el genotipo de los heterocigotos «knockout» (KO)
– La madurez de la F1 se alcanza a los 6 meses – Maduración a los 6 meses
– Cruzar entre sí los heterocigotos para obtener KO homocigotos
– Hacer el genotipo de los KO homocigotos
Analizar la expresión Analizar la expresión
El producto génico se sobreexpresa Características
El producto génico está ausente o mutado
yan sido usadas para dirigir de manera efectiva la ex- ferentes experimentos transgénicos, dependiendo de la
presión transgénica cardíaca. Entre estas secuencias se proteína que se intenta crear. Así por ejemplo, tal
encuentran los promotores de la actina, de la cadena li- como veremos más adelante, muchas de las miocar-
gera de la miosina 2v, y de las cadenas pesadas de la diopatías hipertróficas están causadas por mutaciones
miosina α y β, entre otras6. Se han expresado un gran en las proteínas contráctiles8. Se ha llevado a cabo un
número de transgenes (cientos de ellos) que afectan al estudio detallado del paradigma transgénico utilizando
corazón utilizando los promotores cardíacos específi- muchas de las otras proteínas contráctiles. Estos estu-
cos y se han creado modelos en los que se producen dios muestran que, a pesar de haber una sobreexpre-
eventos de remodelado general, tales como la hipertro- sión importante a nivel del ARN, los niveles proteicos
fia, o enfermedades cardíacas concretas7. Es interesan- permanecen inalterados. Puesto que el ARN transgéni-
te señalar que los resultados, en términos de niveles co se produce en mucha mayor cantidad que el ARN
proteicos totales, pueden variar ampliamente en los di- endógeno, el efecto neto en el cardiomiocito es el de
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en investigación cardiovascular
diluir la proteína endógena con cantidades crecientes inactivación (o mutación) del gen de interés, y genera
del polipéptido transgénico. El resultado final es que animales deficientes (o que tienen una mutación) en
se produce un reemplazo de la proteína endógena por ese producto génico concreto. Esta tecnología se usa
la que es codificada de manera transgénica9. típicamente para inactivar o conseguir genes «knock-
Es importante entender las limitaciones que tiene la outs» en el genoma y de ahí que reciba el nombre de
aproximación experimental transgénica, muchas de las experimento de «pérdida de función». Desde el punto
cuales ya han sido mencionadas anteriormente. En pri- de vista técnico es un procedimiento muy diferente a
mer lugar, conviene insistir en ello, esta técnica se la transgénesis y mucho más largo. Los enfoques con-
basa en el hecho de que cualquier transgén que se ex- vencionales de reconstrucción génica se basan en la
prese tiene que «dominar» el producto génico endóge- recombinación homóloga de ADN electroporado den-
no. En segundo lugar, hay que tener presente la posibi- tro de células madre embrionarias totipotentes11. El
lidad de una potencial mutagénesis por inserción, ADN electroporado contiene normalmente un marca-
incluso en el estado heterocigótico. En tercer lugar, no dor que sirve para identificarlo, de manera que des-
hay que olvidar la cuestión de la sobreexpresión. pués de los correspondientes procedimientos de selec-
Como se ha dicho anteriormente, en el caso de las pro- ción, aquellas células en las que ha tenido lugar una
teínas contráctiles este aspecto no parece ser un pro- recombinación homóloga pueden ser identificadas me-
blema. Además, como grupo control, la proteína origi- diante procedimientos de cribaje molecular, tales
nal puede ser expresada a un nivel similar para como el análisis por Southern o PCR12. Existen mu-
asegurarnos de que el fenotipo no está presente. Sin chas variaciones sobre este procedimiento básico, pero
embargo, los promotores que se utilizan normalmente los aspectos principales permanecen más o menos in-
en estos experimentos proceden de las proteínas con- variables. El ADN que se inserta consiste en regiones
tráctiles. Estos polipéptidos constituyen la mayor parte extensas de homología, que flanquean el lugar de inte-
de la masa proteica de los cardiomiocitos y se expre- rés y que contienen al menos un marcador, y a veces
san en gran cantidad, con un estado de equilibrio en el dos marcadores. El proceso de reconstrucción se plani-
número de transcriptos de ARN que varía de diez a fica para que se produzca una eliminación de las se-
miles. Así pues, un promotor muy activo es parte del cuencias endógenas con elementos de ADN críticos
constructo transgénico. En muchos experimentos en que hacen que la transcripción/traducción del gen pue-
los que se expresan transgénicamente sustancias po- da ser controlada y reemplazada por un marcador se-
tencialmente tóxicas, potentes moléculas de señaliza- leccionado o por una secuencia inocua no codificado-
ción biológica o moléculas amplificadoras, los resulta- ra. Esto da lugar a un «alelo nulo», es decir, un locus
dos son muy difíciles de interpretar. Por ejemplo, en génico que no puede producir un producto de trans-
una publicación reciente se expresó el gen marcador cripción que pueda ser traducido y/o un polipéptido
Green Fluorescent Protein (GFP) usando un promotor funcional. La ablación génica o reconstrucción permi-
específico cardíaco10. La hipertrofia resultante fue in- te estudiar las consecuencias de las alteraciones recesi-
terpretada como que la sobreexpresión de cualquier vas si los animales resultantes son cruzados hasta con-
molécula puede resultar en hipertrofia. Si examinamos seguir homocigotos.
la bibliografía general, veremos claramente que esto Esta estrategia es utilizada fundamentalmente para
no es cierto. Otra explicación posible es que la expre- determinar si un gen concreto tiene una función críti-
sión de GFP en el contexto del corazón comprometió ca, o para explorar la potencia del efecto del gen de-
la función y dio lugar a la hipertrofia resultante. Es de- pendiente del número de copias mediante la elimi-
cir, la GFP no es una proteína dañina, sino que es ca- nación de uno de los alelos. Si el proceso de recons-
paz de producir una respuesta hipertrófica. Así, en un trucción da lugar a un transcripto alterado pero que
experimento en el que se investiga la ganancia de una puede ser traducido, se puede formar un «péptido tóxi-
función, y en el que no hay un grupo control que ex- co» que interfiere con la función de la proteína endó-
prese la proteína original de forma paralela a la proteí- gena, lo que se conoce como una reconstrucción de
na mutante que se está estudiando, la interpretación de tipo «negativo dominante». Además, la recombinación
los resultados puede ser difícil o imposible. homóloga en células madre embrionarias se puede
usar para insertar, en un punto definido, un gran frag-
mento de ADN que lleve incorporado un transgén en-
Reconstrucción génica
tero único13, de tal manera que su actividad y función
La reconstrucción génica (en inglés gene targeting), (o funciones) puedan ser estudiadas sin que haya inter-
a diferencia de la transgénesis, reemplaza la secuencia ferencias con los efectos debidos al número de copias
de ADN endógeno, en un punto previamente seleccio- o a los diferentes contextos cromosómicos.
nado, con ADN preparado exógenamente (y, es de su- En la bibliografía existen numerosos ejemplos de
poner, que alterado). La reconstrucción génica utiliza genes que han sufrido una ablación y que son impor-
la recombinación homóloga para insertar el ADN en tantes para el desarrollo general y la función del cora-
lugares específicos de los genes, lo que produce una zón. A menudo, estos genes remodelados codifican po-
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en investigación cardiovascular
lipéptidos que están pleiotrópicamente involucrados en frecuente que un experimento dure años (mientras que
el desarrollo cardíaco o la estructura básica. Mientras puede tardar meses si se utiliza el enfoque transgéni-
que la ablación puede tener un impacto importante so- co). Esto es especialmente cierto cuando se trata de
bre el aparato contráctil, la deficiencia/remodelado no provocar una mutación en el gen, y no simplemente
es una consecuencia primaria de la mutación nula sino eliminarlo, ya que este tipo de procedimientos requiere
que refleja más bien un déficit más básico que ha teni- 2 procesos de reconstrucción separados20. No obstante,
do lugar en el desarrollo cardíaco normal. Ejemplos de la reconstrucción génica sigue siendo, entre las 2 posi-
ello lo constituyen el «knockout» de hox-1.5, que da bilidades, la aproximación experimental más elegante
lugar a la generalización de anormalidades cardiovas- e intelectualmente satisfactoria, por ser la más precisa.
culares reminiscentes del síndrome de DiGeorge14, o la
ablación de la proteína LIM específica del músculo15
MODELOS OBTENIDOS POR INGENIERÍA
que produce una miocardiopatía dilatada, así como los
GENÉTICA DE ENFERMEDADES
«knockouts» de endotelina-116 y conexina 4317. La eli-
CARDIOVASCULARES
minación de estos genes, cuyas funciones son aparen-
temente necesarias para el desarrollo cardíaco normal Miocardiopatía hipertrófica familiar
y para el establecimiento de la estructura inherente al
miocardio, ha tenido un gran valor informativo, pero Las miocardiopatías hipertróficas familiares (MHF)
no ha aportado una evidencia directa que mejore la incluyen un grupo de desórdenes musculares cardíacos
comprensión de las relaciones que existen entre estruc- primarios caracterizados por una gran morbilidad y
tura y función y que subyacen a la función cardíaca mortalidad. Su clasificación está basada en su fisiopa-
normal y anormal en el adulto. tología y etiología. La miocardiopatía se definió origi-
Las ventajas de la reconstrucción génica sobre la nariamente como una enfermedad no coronaria del
transgénesis pueden ser sustanciales. En primer lugar, músculo cardíaco21. En 1980 la Organización Mundial
se conoce tanto el punto de inserción como el número de la Salud redefinió el término como una enfermedad
de secuencias insertadas. En segundo lugar, el ADN cardíaca de etiología indefinida. Aunque se conocen
mutado se inserta sólo en un punto definido. En tercer varias miocardiopatías de diferentes categorías (dilata-
lugar, si se produce una mutación sin que haya abla- da, hipertrófica, restrictiva/obliterativa), nuestra discu-
ción, esa mutación se expresará bajo el control del sión se centrará fundamentalmente en las MHF. Este
promotor endógeno, lo que produce niveles de expre- tipo de miocardiopatías son heredadas, más que adqui-
sión fisiológicamente relevantes, que mimetizan exac- ridas como consecuencia de una carga cardíaca altera-
tamente los patrones de transcripción endógenos del da22, son autosómicas dominantes y dan lugar a una
gen que se está estudiando. Sin embargo, por diversas miocardiopatía hipertrófica medida como un aumento
razones, los resultados relacionados directamente con de la masa. Las MHF se caracterizan por una hipertro-
el remodelado del corazón a través de la ablación o la fia cardíaca inexplicable sin que haya un aumento de
modificación de genes, especialmente aquellos que co- la carga cardíaca, o en ausencia de otras anormalida-
difican elementos del aparato contráctil, son limitados. des sistémicas. Desde el punto de vista clínico, las en-
Es de esperar que la ablación de un componente crí- fermedades autosómicas dominantes tienen una pene-
tico del aparato contráctil sea letal. Un corazón funcio- trancia variable con ocurrencia de hipertrofia en
nal es crítico para el desarrollo fetal en el día 11-12 cualquier ventrículo; normalmente (en > 95%) tam-
del período embrionario del ratón. Si el corazón se en- bién está involucrado el septum intraventricular23. His-
cuentra seriamente comprometido, el feto raramente tológicamente se observa una desorganización caracte-
sobrevive más allá del día 12,5 del período embriona- rística de los miocitos y de las miofibrillas. A menudo
rio. Así pues, los animales homocigotos que contengan también se puede apreciar una morfología nuclear ex-
una mutación nula en los 2 alelos no llegarían a térmi- traña y cariomegalia, aunque estas características pue-
no, morirían durante la embriogénesis y serían reab- den ser dependientes de la edad y no estar presentes en
sorbidos18. Antes de entrar en las dificultades de crear los niños24. Los hallazgos histopatológicos también in-
un animal genéticamente reconstruido es recomenda- cluyen a menudo una fibrosis extensiva que puede ser
ble tener la infraestructura analítica necesaria, que no focal o intersticial25. Como grupo de enfermedades, las
ha estado disponible durante mucho tiempo en el caso MHF son bastante comunes, y hay estudios indepen-
de la evaluación de la función cardíaca en el útero. dientes que estiman que uno de cada 500 individuos
Nuestra capacidad para discernir una función contrác- está afectado26,27. Las MHF son una causa importante
til cardíaca en el embrión intacto a media gestación, de muerte súbita en adultos jóvenes aparentemente
medida por el volumen de eyección y la frecuencia sanos28. Un estudio reciente ha calculado que entre
cardíaca, ha sido bastante limitada hasta ahora pero 35 adultos jóvenes que presentaron muerte cardíaca
está mejorando rápidamente19. Otro aspecto crítico es súbita, 12 fueron por causa de MHF29. Incluso dentro
que la reconstrucción génica es una técnica que re- de una misma familia en la que la enfermedad es debi-
quiere mucho tiempo para llevarse a cabo, y no es in- da a un único defecto genético, la severidad, inicio y
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penetrancia de la patología es altamente variable (pro- (MyBP-C), la tropomiosina (α-Tm), la troponina T
bablemente debido a la existencia de loci modificado- cardíaca (cTnT), la troponina I (cTnI), la actina y la ti-
res, aunque esto no se ha podido demostrar todavía de tina8,36. Clínicamente la MHF induce eyección hiperdi-
manera concluyente). La penetrancia es dependiente námica, relajación reducida, retraso en el llenado ini-
de la edad, con un comienzo que ocurre normalmen- cial, desorganización de los miocitos y fibrosis, y
te en la adolescencia25,30,31. aumento de la rigidez cameral telediastólica. El diag-
El decisivo artículo de Geisterfer-Lowrance et al32 nóstico normalmente se basa en el examen físico y
fue el primero en establecer una base genética en la ecocardiográfico, aunque en los niños es particular-
etiología primaria de esta enfermedad. Mediante técni- mente difícil hacer un diagnóstico correcto porque
cas de ligamiento génico acopladas con aproximacio- puede ser que no tengan hipertrofia cardíaca hasta que
nes experimentales de biología molecular, y aprove- alcanzan la edad adulta.
chando su gran experiencia, el grupo de Seidman Aunque el conocimiento de la etiología de la enfer-
estableció que los trastornos ligados a la FHC se en- medad a nivel de su genética molecular está muy avan-
contraban localizados en el cromosoma 14q11. Ellos zado, siguen sin conocerse bien los procesos patogéni-
fueron los que demostraron que en todos los indivi- cos responsables de su morbilidad y mortalidad. Esto
duos afectados de la misma familia había una muta- se debe a que la descripción de estos procesos tiene
ción puntual en el exón 13 del gen de la cadena pesada que realizarse necesariamente a lo largo de períodos
β de la miosina cardíaca (β-MyHC). Este gen codifica prolongados de tiempo, y en una población en la que
las principales proteínas motoras responsables del el comportamiento y el entorno no están controlados.
bombeo del ventrículo adulto. La mutación convertía Con el fin de mitigar estas dificultades, se está reali-
un residuo de arginina altamente conservado (Arg403) zando un gran esfuerzo para generar modelos animales
en uno de glutamina (Arg403Gln). Desde esta obser- relevantes en los que la progresión de la enfermedad
vación inicial, se han mapeado más de 50 diferentes pueda ser rigurosamente estudiada en condiciones
mutaciones puntuales de la β-MyHC que producen va- controladas. El desarrollo de estos modelos animales
rias sustituciones de aminoácidos: las mutaciones en ha arrojado luz sobre la patogenia de la MHF, permi-
este gen son responsables de aproximadamente un 30- tiendo establecer vínculos entre las mutaciones genéti-
40% de las MHF en la población general. Este gran cas y los déficit funcionales concretos. En teoría, una
número de mutaciones diferentes, y su localización va- proteína sarcomérica mutante que presumiblemente
riable dentro de la molécula de MyHC ayuda, en parte, causa el desarrollo de una enfermedad puede alterar la
a explicar la enorme variabilidad en la severidad de función sarcomérica al menos por 2 mecanismos dife-
esta enfermedad: mutaciones diferentes tienen efectos rentes:
diferentes sobre la capacidad de la MyHC para realizar – Puede funcionar como un «péptido tóxico», ejer-
su función. Por ejemplo, la mutación Arg403Gln es al- ciendo un efecto negativo dominante. La proteína alte-
tamente penetrante y tiene efectos severos sobre la rada es incorporada en el sarcómero, lo que conduce a
morbilidad y mortalidad de la población afectada. El cambios estructurales y al desarrollo de hipertrofia
residuo está localizado cerca del lugar de unión del compensatoria.
nucleótido, y es en este punto donde la cabeza de la – Puede actuar como un «alelo nulo», con capacidad
miosina participa en la interacción actina-miosina. Así potencial de producir haplo-insuficiencia. La produc-
pues, la mutación se encuentra en y cerca del lugar crí- ción de cantidades insuficientes de proteína normal
tico para ejercer las funciones motoras33. produce un desequilibrio en la estoiquiometría del sar-
La genética de las miocardiopatías dilatadas y arrit- cómero, que altera la estructura y la función sarcomé-
mogénicas no es tan bien conocida ni comprendida ricas.
como la de las MHF, aunque se han descrito varios Más adelante comentaremos brevemente ejemplos
loci génicos y se han identificado unos pocos ge- relevantes que ilustran el potencial de los modelos ani-
nes34,35. Igual que en el caso de la MHF, este tipo de males para descubrir los déficit de las enfermedades
desórdenes puede presentar características clínicas he- primarias.
terogéneas y una morbilidad variable, y otros genes
modificadores ejercen, sin duda, influencia sobre la
La cadena pesada de la miosina
mortalidad.
Actualmente sabemos que la MHF es un desorden La cadena pesada de la miosina (MyHC) es, por su
genético autosómico dominante que se deriva de muta- masa, el principal componente de los filamentos grue-
ciones en diferentes genes codificadores de proteínas sos del sarcómero y proporciona la función motora de
sarcoméricas que constituyen los filamentos gruesos, la contracción cardíaca. La miosina es una proteína
finos y los filamentos de titina. Se han identificado hexamérica que está formada por 2 cadenas pesadas
múltiples mutaciones en los genes de la β-MyHC, las (PM aproximado de 220 KDa) y 2 pares de cadenas li-
cadenas ligeras esencial y reguladora de la miosina geras no idénticas (PM aproximado de 18-27 KDa).
(ELC y RLC), la proteína C que se une a la miosina Las cadenas pesadas están formadas por 2 dominios
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Fram8823 G584R, D587V R694C R723C L908V
K383N L6o1V N696S P731L E924K
del 10 K246Q L390V N602S R712L I736M D1-930
A26V T124I Q222K R249Q R404Q E483K V6o6Lnuclear G716R G741R D778G E846K E930K
R54x R143Q R190T N232S G256E R403W K450E Q499K V606M R663C R719W G741W S782N E846Q E935K
V59I Y162C N187K F244L I263T A326P R403L R453C F513C K615N R615H R719Q G741A A797T R870H E949K * Spl23793
A
Ex: 3 5 7 8 9 11 13 to 16 18 to 22 23 27 In 39
Arg 403 Gln ratón, conejo
1935 residuos de aminoácido
S1 S2 LMM
B H2N- 23 kDa 50 kDa 24 kDa 51 kDa 77 kDa -COOH
ATP Actina
C Arg403Gln en el ratón Enfermedad humana Arg403Gln en el conejo
(Geisterfer et al, 1996) (Marian et al, 1999)
– Reconstrución génica
– La ablación del 100% es letal Aproximadamente – Transgénesis
Modelo b-MHC + promotor de b-MHC murina
– La ablación del 50% es viable con 30% de MHF
anomalías Reemplazamiento proteico = 41%
– Alterada
Función – Alta incidencia de muerte cardíaca Igual – Función sistólica normal
cardíaca súbita (MCS) – Alta incidencia de MCS
Anatomía Ocurre después de la disfunción cardíaca
patológica Igual – Desorganización de miocitos
– Desorganización de miocitos – Aumento de colágeno
– Fibrosis
Hipertrofia Presente Presente Presente
Consecuencias – Anomalías electrofisiológicas dependientes
del sexo Igual
–Capacidad de esfuerzo comprometida
– Evidencia de que la mutación Arg403Gln – Evidencia de que la proteína mutante
Mecanismo/ es la causa PRIMARIA de la enfermedad actúa mediante un efecto negativo
evolución – Evidencia de la base genética de la MHF dominante
– Hipertrofia desarrollada en respuesta a – Evidencia de la base genética de la MHF
un aumento de función debido a la mutación
Fig. 1. Las mutaciones de la cadena pesada β de la miosina en la MHF. (A) Se indican las mutaciones humanas previamente descritas, el color rojo
se refiere a las más malignas. La organización intrón-exón del gen está representada y los exones afectados aparecen en azul. Las mutaciones que
han sido obtenidas en modelos animales genéticamente modificados se muestran debajo del diagrama del intrón-exón. (B) Representación esque-
mática de la proteína β-MHC codificada por el gen MYH7, con sus dominios y sus lugares de unión. (C) Características principales de los modelos
animales que reproducen algunas de las mutaciones humanas, comparación con la enfermedad humana y la patogenia de la enfermedad. Las mu-
taciones con pérdida de sentido están representadas por la letra que codifica el residuo de aminoácido (aa) que está mutado seguido por el número
de la posición del aa, seguido por la letra del nuevo aa. Las mutaciones por truncamiento pueden ser consecuencia de mutaciones del lugar de cor-
te y empalme (Splx; donde x es la posición de la mutación del nucleótido), mutaciones por deleción (dely o ∆1-y; donde y es la posición numérica
del último residuo de aminoácido presente en la proteína truncada), y mutaciones con desplazamiento de marco (Framz; donde z es la posición de
la mutación del nucleótido). * indica una mutación de sustitución compleja que afecta a los genes MYH6 y MYH7. Ex: exón; In: intrón.
separados: una cabeza globular unida a una cola α-he- formas, la α y la β. Las isoformas α y β están codifi-
licoidal por una región bisagra. Las cabezas, localiza- cadas por los genes MYH6 y MYH7, respectivamente,
das en el extremo aminoterminal de la molécula, con- y están organizadas en tándem agrupadas en el cromo-
tienen la región catalítica de la ATPasa, y un lugar de soma 14q11.2-q13, con el gen MYH7 localizado 4 ki-
unión para la actina. Además, las cadenas ligeras están lobases por encima del MYH6. El gen MYH7 está
unidas a cada cabeza por la región de unión cabeza- compuesto por 40 exones, y codifica una proteína de
cola, también llamada «cuello», «región bisagra» o 1.935 residuos de aminoácidos (fig. 1). Las isoformas
«subfragmento-1» (S1). Las cadenas pesadas de la α y β están organizadas como homodímeros V1 y V3,
miosina determinan las diferentes funciones motoras respectivamente. Bajo determinadas condiciones, pue-
de los diferentes tipos musculares y constituyen una de estar presente una forma heterodimérica interme-
familia de genes37, y en el corazón se expresan 2 iso- diaria llamada V2, que está constituida por los produc-
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tos génicos α y β. Los homodímeros V1 y V3 tienen evidencia definitiva de la base genética de la MHF, y
diferentes actividades ATPasa intrínsecas, siendo V1 la han demostrado que la disfunción cardíaca es la res-
más activa (alrededor de tres o cuatro veces más). Es- puesta principal a la mutación Arg403Gln de la miosi-
tas diferentes isoformas están presentes en cantidades na. Es interesante señalar que los heterocigotos ma-
variables, y existe una buena correlación entre la velo- chos jóvenes presentaron un fenotipo más severo que
cidad de contracción y la relación entre V1/V3. Así, el las hembras, tal como se comprobó por la presencia de
ventrículo humano contiene fundamentalmente V338,39, anormalidades electrofisiológicas que estuvieron liga-
mientras que el ventrículo de ratón adulto, que alcanza das al sexo59,60. Los machos se encuentran afectados a
una frecuencia de 500-800 latidos por minuto, contie- una edad más temprana que las hembras, aunque se
ne V1. desconocen las causas de estas diferencias ligadas al
En la población humana existen múltiples mutacio- sexo. La capacidad para hacer ejercicio está compro-
nes en la β-MyHC de la MHF. Hasta la fecha se han metida en los heterocigotos53. En el futuro, este mode-
identificado más de 63 mutaciones distintas. Estas mu- lo de ratón para la MHF va a permitirnos continuar el
taciones se encuentran distribuidas a lo largo de la mo- estudio del impacto que tiene el genotipo, la dieta y la
lécula, pero la mayor parte están localizadas en la mi- actividad física sobre el fenotipo.
tad aminoterminal, con grupos en la región de la Se han evaluado las consecuencias funcionales de la
cabeza globular, en el lugar de la unión del ATP o de mutación Arg403Gln a nivel molecular61: la actividad
la actina, en los lugares de unión de la cadena ligera33, cíclica de la actina está acelerada, y ésta puede ser la
en la zona de unión cabeza-cola, así como en unos po- causa de la mayor velocidad en el aumento de la pre-
cos lugares de la región de la cola. Se han descrito mu- sión observada in vivo55, así como de la mayor veloci-
taciones sin sentido y mutaciones con pérdida de senti- dad en el desarrollo de fuerza en tiras musculares62.
do, y deleciones, y esta diversidad es responsable, al Esta ganancia de la función es consistente con el feno-
menos en parte, de la gran variabilidad en la presenta- tipo hemodinámico observado en los humanos, y pro-
ción clínica de la MHF. De este modo, el clínico se en- bablemente estimula el desarrollo de una hipertrofia
frenta a enormes diferencias en términos de grado de compensatoria que no es debida a una disminución en
hipertrofia, inicio y evolución de los síntomas de la en- la capacidad de generar fuerza sino que, por el contra-
fermedad, ocurrencia de muerte cardíaca súbita y pro- rio, está relacionada con una demanda energética cró-
nóstico del paciente (clasificado como benigno o ma- nicamente aumentada en el miocardio. En este mode-
ligno). Los efectos de las diferentes mutaciones sobre lo, la hipertrofia compensatoria aumentaría la masa
las funciones de la cadena pesada de la miosina se tisular para reducir el estrés de pared y la utilización
acompañan de pronósticos distintos. Las principales energética por unidad de volumen del miocardio. En
mutaciones clínicas asociadas con un pronóstico ma- última instancia, la validación de este modelo de ratón
ligno incluyen la Arg403Gln32,40-42, Arg453Cys33,43,44, procederá de experimentos en los que se mida la fuer-
Gly716Arg33,45,46, Arg719Trp45,47,48 y, dependiendo del za y la velocidad de deslizamiento de la β-MyHC hu-
origen étnico de los pacientes, Val606Met42,44,49-51. La mana y de los filamentos finos reguladores del cora-
sustitución Arg403Gln tiene consecuencias dramáti- zón. Las investigaciones que se realicen usando estos
cas, y el 50% de los individuos afectados mueren a la modelos deberían ayudar a mejorar el manejo clínico
edad de 40 años41,52. de la MHF en humanos, y a establecer dianas terapéu-
Con el objetivo de estudiar sus consecuencias y uti- ticas y/o intervenciones diseñadas para enlentecer o re-
lizando la técnica de la reconstrucción génica, se ha vertir el desarrollo del fenotipo hipertrófico de la MHF
generado en el ratón la mutación con pérdida de senti- y otras miocardiopatías (fig. 1).
do Arg403Gln (R403Q)53. Este ratón ha sido analizado ¿Hasta qué punto es válido extrapolar los resultados
extensivamente a lo largo de su vida y ha proporciona- obtenidos en ratones a los humanos? Para abordar esta
do información valiosa relativa a la historia natural de cuestión, Roopnarine et al63 colocaron 3 mutaciones
esta enfermedad. En los humanos la mutación sólo humanas en la α-MyHC de roedor y examinaron las
está presente en la forma heterocigótica y, de acuerdo actividades de la ATPasa. Curiosamente, el grado de
con esta observación, el ratón homocigótico muere a afección de la enzima de las miosinas mutantes se co-
los pocos días de nacer54. Los individuos heterocigotos rrelacionó con el fenotipo clínico de los pacientes que
sedentarios sobrevivieron, lo que demuestra que la tenían la correspondiente mutación. Estos datos sugie-
presencia de la mutación de la miosina Arg403Gln da ren que, a pesar de las diferencias entre especies, los
lugar a una función cardíaca anómala pero compatible modelos animales pueden ser perfectamente predicti-
con la vida. Los heterocigotos presentaron la misma vos para los humanos. Otro enfoque para responder
histopatología y fisiopatología55-58 que se había obser- esta pregunta es generar animales más grandes que
vado en la forma humana de MHF. La disfunción car- contengan el locus de la enfermedad. Hasta el momen-
díaca precedió los cambios histopatológicos, y la des- to, la mutación Arg403Gln se ha generado también en
organización miocitaria, hipertrofia y fibrosis aumen- el conejo que, como en humanos, y a diferencia del ra-
taron con la edad53. Estos datos han proporcionado una tón, expresa la misma isoforma β-MyHC cardíaca (las
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