SENSISpec INgezim GLUTEN R5 - Eurofins Technologies
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
Prod Ref: 30.GLU.K2
Saggio immunoenzimatico a sandwich con doppio anticorpo per l’analisi quantitativa
del glutine in campioni alimentari
Ultima revisione: 13-10-2020ESPAÑOL
SENSISpec INgezim GLUTEN R5
30.GLU.K2
COMPOSICION DEL KIT
1 placa (8x12 pocillos)
Reactivo
Uni. Vol.
Placas de microtitulación (8x12 pocillos) recubierta con el AcM R5,
específico de gliadinas, secalinas y hordeínas 1
Control Positivo listo para su uso
1 1.5 mL
Control Negativo listo para su uso
1 1.5 mL
Punto control (20 X concentrado)
1 250 µL
Estandar europeo de gliadina a las concentraciones de 25 ng/ml, 12.5
ng/mL, 6.25 ng/mL,3.12 ng/mL y 1.56 ng/ml listos para su uso 5 1.5 mL
AcM R5 anti gliadina, secalina, hordeina, conjugado con peroxidasa
(listo para su uso) 1 15 mL
Tampón de extracción, listo para su uso
1 110 mL
Solución de lavado (25x concentrado)
1 65 mL
Diluyente (DE12-05) (5x concentrado)
1 65 mL
Sustrato (TMB)
1 15 mL
Solución de frenado (H2SO4 0,5M)
1 15 mL
OTROS MATERIALES Y REACTIVOS NO INCORPORADOS EN EL KIT
Etanol
Agua Destilada
El kit SENSISpec INgezim Gluten R5 ha sido aprobado como AOAC Research Institute Performance
Tested MethodsSM, con el número de certificación #052005, para mezcla de pan sin gluten, harina de avena y
muestras de superficies de acero inoxidable.
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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I. FUNDAMENTO TECNICO DEL KIT
gliadinas anteriormente fijadas. Tras otro paso de
Ingezim gluten es un inmunoensayo enzimático lavado la presencia del AcM peroxidasa se detecta
Sándwich de doble anticuerpo. Sobre un soporte tras la adición de un sustrato adecuado a la
de poliestireno recubierto con el anticuerpo peroxidasa (TMB) que producirá una reacción
monoclonal R5 (AcM) que reconoce colorimétricamente medible.
específicamente gliadinas, secalinas y
hordeínas, se añade la muestra. En el caso de Con INgezim Gluten es posible cuantificar la
que contenga gluten, estas proteínas serán cantidad de gluten de una muestra con un límite
capturadas y quedarán fijadas al pocillo. Tras un de cuantificación 3 ppm de Gluten.
paso de lavado para eliminar el material no
adherido se añade el mismo AcM (R5) esta vez
conjugado con peroxidasa, que se unirá a las
II. PRECAUCIONES
1. Leer atentamente las instrucciones de uso 8. Utilizar una punta de pipeta nueva por cada
2. Mantener los reactivos a temperatura muestra a testar.
ambiente antes de su utilización. 9. Incluir sistemáticamente los controles y los
3. No mezclar reactivos ni instrucciones de puntos de la curva patrón siempre que se
diferentes kits. utilice el kit.
4. Evitar cualquier contaminación de los 10. ¡IMPORTANTE! : El sustrato es muy sensible
reactivos. a la luz y a las contaminaciones. Retirar del
5. No utilizar los kits una vez superada la fecha bote de sustrato únicamente el volumen que
de caducidad. vaya a utilizarse y nunca devolver el sobrante
al bote.
6. No comer, beber ni fumar mientras se
manipulen los reactivos y/o las muestras. 11. La solución de frenado ha de ser manipulada
7. No pipetear los reactivos con la boca. con precaución ya que es un ácido fuerte.
III. NORMAS PARA LA CORRECTA CONSERVACION DE LOS REACTIVOS
Todos los componentes deben ser almacenados entre +2ºC y +8ºC. NO CONGELAR NINGUNO DE
ELLOS.
Evitar la exposición del kit y los componentes a la luz del sol, ya que algunos reactivos son
sensibles a ella.
IV. INFORMACION SOBRE EL MODO DE REALIZAR LOS LAVADOS
Volcar la placa bruscamente para vaciar su
Los lavados pueden realizarse mediante un frasco
contenido.
lavador, un lavador automático de placas o
mediante una micropipeta que permita dispensar Repetir el proceso cuantas veces sea indicado
la cantidad de 300 l por pocillo. Tras las en el procedimiento.
incubaciones, realizar los lavados según las
siguientes instrucciones: Antes de eliminar el contenido del ultimo
lavado, asegurarse de tener preparado el
Eliminar el contenido de la placa volcándola reactivo a utilizar inmediatamente. No debe
bruscamente para evitar el intercambio de mantenerse la placa en seco.
fluidos entre los pocillos.
Tras el último lavado, sacudir la placa boca
Distribuir unos 300 L de solución de lavado abajo sobre un papel de filtro absorbente.
por pocillo.
Agitar delicadamente la placa evitando el
intercambio de material entre pocillos.
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V. PREPARACION DE LOS REACTIVOS:
Conjugado, Controles y puntos de la Diluyente
curva patrón Diluir un volumen de solución concentrada
Se encuentran listos para usar y no precisan en 4 volúmenes de agua destilada. Una vez
de ningún tratamiento. Añadir 100 µl de preparada, la solución permanece estable
cada solución directamente al pocillo. mantenida entre +2ªc y +8ºC, hasta la
fecha de caducidad del kit.
Solución de lavado
Punto control
Diluir un volumen de solución concentrada
en 24 volúmenes de agua destilada. Una vez Realizar dilución 1:20 en diluyente (ej. 25
preparada, la solución permanece estable µL + 475 µL de diluyente). Agitar bien la
mantenida entre +2ºC y +8ºC, hasta la solución antes de su utilización.
fecha de caducidad del kit. Preparar el volumen necesario a utilizar ya
que la solución sobrante ha de ser
desechada.
VI. PREPARACION DE LA MUESTRA
Muestras procesadas por calor o que contengan Muestras que contengan taninos o polifenoles
soja: (chocolate, vino tinto, zumos de frutas muy
coloreados…)
1. Pesar 0.25 g de la muestra de alimento molido y 1. En un tubo de propileno de 10 mL, pesar 0.25 g de
depositarlo en un tubo de propileno de 10 ml. gelatina y 0.1 g de Polyvinyl-pyrrolidone.
2. Añadir al tubo 2.5 mL del tampón de extracción. (Polyvinylpyrrolidone Sigma PVP-360) (Gelatina de
3. Cerrar los tubos con el tapón rosca/presión y pescado Sigma No. G-7041).
sellarlos con papel parafilm para evitar 2. Pesar 0.25 g de muestra del alimento molido y
evaporación. añadirlos al tubo.
4. Mezclar en el vortex (5-10 segundos) 3. Añadir 2.5 mL de Tampón de Extracción.
5. Incubar entre 20 y 60 min a temperatura 4. Cerrar los tubos y sellarlos con parafilm para evitar
ambiente (los datos no cambian la evaporación debida al calor.
significativamente a partir de los 20 min de 5. Mezclar con vortex hasta que la muestra esté
incubación). Se recomienda agitar la mezcla 2-3 completamente mezclada.
veces durante la incubación. 6. Incubar los tubos de 20 a 60 min a temperatura
6. Añadir 7.5 ml de etanol al 80%, agitar con vortex ambiente (los datos no cambian significativamente
durante 10-60 segundos e incubar entre 20 y 60 a partir de los 20 min de incubación).
min a temperatura ambiente (los datos no 7. Añadir a la muestra 7.5 mL de Etanol al 80% e
cambian significativamente a partir de los 20 min incubar de 20 a 60 min a temperatura ambiente
de incubación), con agitación (se recomienda un con agitación, (los datos no cambian
agitador rotatorio de 45 revoluciones por minuto). significativamente a partir de los 20 min de
incubación).
7. Centrifugar a 2000-2500 g durante 10 minutos, a
8. Centrifugar las muestras durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
2000-2500 g a temperatura ambiente.
8. Pasar el sobrenadante a tubos limpios de 9. Recoger el sobrenadante en tubos de propileno
propileno y a continuación analizarlos por ELISA. de 10 ml limpios.
10. Estos extractos en Tampón de extracción-
Muestras no procesadas por calor y que no gelatina han de almacenarse a temperatura
contengan soja. ambiente.
1. Pesar 0.25 g de la muestra de alimento molido
y depositarlo en un tubo de propileno de 10 Muestras de superficie (tomadas con torunda)
ml.
2. Añadir 10 mL de etanol al 60% e incubar entre 20 IMPORTANTE: este procedimiento sólo sirve para
y 60 min a temperatura ambiente (los datos no tener una idea de la posible presencia/ausencia de
cambian significativamente a partir de los 20 min gluten en una superficie.
de incubación), con agitación
3. Centrifugar a 2000-2500 g durante 10 minutos a Con las muestras tomadas con torunda no es posible
temperatura ambiente. cuantificar, ya que no sabemos de qué cantidad de
4. Pasar el sobrenadante a tubos limpios de propileno muestra partimos.
y a continuación analizarlos por ELISA.
Teniendo en cuenta que con la torunda se coge poca
cantidad de muestra, el procedimiento es igual que
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el normal, pero usando menores volúmenes de Durante el almacenamiento se recomienda sellar
solución de extracción y etanol (manteniendo perfectamente los tubos con parafilm, para evitar la
siempre la misma proporción que el tratamiento evaporación del etanol.
original).
La muestra ya preparada se diluirá según los
1. Una vez tomada la muestra, cortar la torunda e siguientes criterios:
introducirla en un tubo de propileno de 10 mL. Para muestras con niveles de gluten esperables
2. Añadir al tubo 1mL de Solución de Extracción. menores de 50 ppm de gluten se recomiendan las
3. Cerrar el tubo con el tapón/rosca a presión y diluciones 1:25 y 1:50.
sellarlo con parafilm para evitar la evaporación. Para muestras con niveles esperables entre 50 y
4. Mezclar en el vortex (5-10 segundos). 100 ppm se recomiendan las diluciones 1:50 y
5. Incubar entre 20 y 60 min a temperatura ambiente 1:100
(los datos no cambian significativamente a partir Para muestras con contenidos de gluten entre 100 y
de los 20 min de incubación). 200 ppm se recomiendan diluciones entre la 1:100 y
6. Sin sacar la torunda, añadir 3mL de etanol al 80%, 1:200.
agitar con vortex durante 10-60 segundos e
Para muestras con contenidos de gluten entre 200 y
incubar entre 20 y 60 min a temperatura ambiente
300 ppm se recomiendan diluciones entre la 1:200 y
(los datos no cambian significativamente a partir
1:400.
de los 20 min de incubación), con agitación.
7. Sacar la torunda y analizar en el ELISA las Para muestras con contenidos de gluten entre 300 y
diluciones 1:12.5 y 1:25 de la solución resultante. 600 ppm se recomiendan diluciones entre la 1:400 y
8. Comparar los valores de Densidad Óptica de 1:800.
dichas diluciones con el estándar inferior Se recomiendan las siguientes formas de realizar
proporcionado con el kit, para poder tener una las diluciones propuestas:
idea de la posible presencia/ausencia de gluten en 1:25 = 960µL diluyente + 40µL muestra
la muestra de superficie analizada (considerando 1:50 = 980µL diluyente + 20µL muestra
siempre el Límite de Detección del Ensayo) 1:100 = 990µl diluyente + 10µL muestra
1:200 = 1990µL diluyente + 10µL muestra
INDICACIONES GENERALES
1:400 = 1995µL diluyente + 5µL muestra
El extracto se puede conservar durante 7 días a
temperatura ambiente, y hasta 1 mes a 4ºC. 1:800= 3995µL diluyente + 5µL muestra
VII. PROCEDIMIENTO
1. Antes de comenzar el ensayo equilibrar 6. Añadir 100 µL de sustrato por pocillo.
todos los componentes del kit, al menos 30 Mantener la reacción 10 minutos a
min a temperatura ambiente. temperatura ambiente. Se recomienda la
2. Dispensar 100 µL del control positivo y utilización de una pipeta multicanal a fin de
negativo así como de los 5 puntos de la agilizar en lo posible este proceso.
curva patrón, por duplicado. Dispensar 7. Añadir 100 µL de solución de frenado, con
seguidamente 100 µl de las muestras objeto de parar la reacción. Se recomienda
(diluidas según instrucciones anteriores) añadir este reactivo en el mismo orden en
también por duplicado. que se añadió el sustrato. En caso de
Tapar la placa e incubar 1 hora a reacción positiva la solución de frenado
temperatura ambiente (22-25ºC). provocará el cambio de color de azul a
amarillo.
3. Lavar 3 veces según procedimiento descrito
anteriormente. 8. Leer los valores de absorbancia a 450 nm
en los 5 min siguientes a la adición de la
4. Añadir 100µL de conjugado en cada pocillo.
solución de frenado.
Mantener 1 hora a temperatura
ambiente (22-25ºC). Se recomienda la
utilización de una pipeta multicanal a fin de
agilizar en lo posible este proceso
5. Lavar 3 veces según procedimiento descrito
anteriormente.
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VIII. LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS:
La lectura se realizará a 450nm 1/1000: factor que procede de la conversión de
Validación del test: ng/ml en ppm.
El test se considerará válido cuando la
absorbancia del control positivo sea superior al INFORMACION ADICIONAL
punto de 25 ng/mL y el control negativo inferior Para que los cálculos realizados sean correctos, los
al punto de 1.56 ng/mL. valores de absorbancia de las muestras deben estar
incluidos dentro de la curva. En caso contrario se
debe repetir el ensayo con otras diluciones de la
Interpretación de los resultados: muestra.
Sólo en el caso en el que el valor de absorbancia
El contenido de gluten de la muestra se obtenido sea ligeramente superior al punto de 25
cuantifica de la siguiente manera: ng/mL (hasta un 15%) podrá darse por válido el
ensayo pero habrá que incluir en la curva patrón el
control positivo, ya que este se corresponde con el
Construir la curva patrón (ver ejemplo) punto de 50 ng/mL
Determinar la concentración de gliadina de la • Punto control: Este es un punto de control interno
muestra extrapolando su valor de absorbancia del ensayo pensado para comprobar en cualquier
en dicha curva (ver ejemplo). momento el buen funcionamiento del kit. Por tanto,
Con este dato aplicar la siguiente fórmula no es obligatorio su uso, aunque sí recomendable.
para determinar la cantidad de gluten en la Modo de uso:
muestra: Diluir 1:20 en el diluyente y añadir 100 µL al
ppm de gluten = C x D x 2 x 40 / 1000 pocillo para realizar el ensayo.
Su D.O debe de ser como el punto de 25 ng/mL
C: es la concentración de gliadina de la muestra permitiéndose una desviación de ± 0.2
determinada en la curva Si este valor de D.O se trata como si fuera una
D: es el factor de dilución de la muestra (25, 50, muestra y se incluye en la fórmula para
100, 200, 400, 800, etc. determinar la cantidad de gluten, su valor será
de 40 ± 8 ppm de gluten.
2: factor que se aplica para convertir gliadina en
gluten.
40: factor que se aplica porque 0.25g de alimento
son extraídos con 10 ml de solución de
extracción
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ng/m l
EJEMPLO:
ng/ml de gliadina Abs450 30
25
25
1) DO del control positivo = 25 1.44 1.8220
2) DO del control negativo = 12,5 1.08 0.1315
3) DO de los puntos de la curva: 10
6,25 0.73 5
1,56
3,12 0.47 0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
1.56 0.32
Abs 450nm
4) La concentración de gliadina de la muestra (C) se puede extrapolar de la curva estándar usando el software apropiado. Por
ejemplo:
Software: Excel (Microsoft)
Seleccionar tanto las concentraciones como las DO obtenidas y ng/ml
30
pinchar en “ asistente para gráficos” 25
y = 15,154x2 - 6,4417x + 2,4497 25
Seleccione tipo de gráfico: “XY (dispersión)” y “terminar” 20 R2 = 0,9974
Pinchar en la ventana superior “Gráfico” y seleccionar “ Agregar línea 15
de tendencia” 10
En el nivel “Tipo”, seleccionar “Polynomial” 5
1,56
0
En el nivel “Opciones”, seleccionar “Presentar ecuación en el gráfico”.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
En esta ecuación sustituir la X por la DO de la muestra para obtener
el valor “C” Abs 450nm
ng/ml de gliadina ppm de Media
Muestra Dilución(D) DO
(C)* gluten (ppm de gluten)
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KIT COMPOSITION
1 plate box (8x12 wells)
Reagent
Uni. Vol.
96 well microtitration plates (12x8 wells) coated with the R5 Mab,
1
specific for gliadin, secalin, and hordein
1 1.5 mL
Positive control ready to use
Negative control ready to use 1 1.5 mL
Control point (20 x concentrated) 1 250 µL
Vials with Gliadin European Standard containing solutions of 25 ng/mL,
5 1.5 mL
12.5 ng/mL, 6.25 ng/mL, 3.12 ng/mL and 1.56 ng/mL ready to use
Vials with an anti-gliadin, secalin and hordein R5 Mab-peroxidase
1 15 mL
conjugate (ready to use)
Bottle with extraction buffer (ready to use) 1 110 mL
Bottle with Washing solution 25x concentrated 1 65 mL
Bottle with Diluent (DE12-05) (5x concentrated) 1 65 mL
Bottle with Substrate (TMB) 1 15 mL
Bottle with Stop Solution ( H2SO4 0,5M) 1 15 mL
OTHER MATERIALS AND REAGENTS NEEDED NOT PROVIDED WITH THE KIT:
Ethanol
Distilled water
The SENSISpec INgezim Gluten R5 kit has been granted AOAC Research Institute Performance Tested
MethodsSM status, and assigned certification number #052005, for gluten-free bread mix, oat flour and
stainless steel surfaces.
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I. TECHNICAL BASIS
This kit is based on a double antibody sandwich This conjugated Mab will bind to the captured
enzyme immunoassay (DAS or capture Elisa). gliadins and after a washing step the peroxidase
We make a brief description of the technique action will be detected by adding the TMB
below: substrate. Change of the colourless substrate
The plate is coated with the R5 monoclonal solution into a blue product and then, after addition
antibody (Mab), which recognises an epitope of stop solution, into a yellow colour can be
common to gliadins, secalins and hordeins. measured with an ELISA reader.
Therefore, when a sample is added into the Gliadin content of the samples will be determined
wells, the capture R5 Mabs will bind the gliadins by extrapolation of their OD in the calibration curve
present in it. A second R5 Mab, conjugated with done with the gliadin standard supplied with the kit.
Peroxidase is added after a washing step. The sensitivity of the assay is 3 ppm of gluten.
II. PRECAUTIONS AND WARNINGS FOR USERS:
1. Read the use instructions carefully. 7. Do not pipette by mouth.
2. Bring all reagents to room temperature (22°- 8. Use a new tip for each new sample.
25°C) prior to use. 9. Include the controls and the standard curve
3. Do not mix instructions or reagents from every time the assay is run.
different kits. 10. IMPORTANT TMB Substrate must be
4. Avoid any contamination of the reagents of the handled with care, it is very sensitive to
Kit. light and contamination: pipette a sufficient
5. Do not use components after expiration dates amount for the assay from the substrate
and do not mix components from different lots. storage bottle into a separate dark
container prior to colour develop step.
6. There should be no eating, drinking, or
smoking where specimens or Kit reagents are 11. Stop solution is a strong acid. Handle with
being handled. care
III. STORAGE OF THE KIT COMPONENTS:
All components must be stored between +2ºC and +8ºC. DO NOT FREEZE ANY OF THE KIT
COMPONENTS.
Avoid exposure of the kit and the components to direct sunlight at any time, as some reagents are
light sensitive.
IV. INFORMATION ABOUT THE WASHING STEPS:
The washing steps may be done using a squeeze Turn over the plate briskly to empty the
bottle, an automatic washing machine or a wells.
multichannel pipetting device suitable for dispensing Repeat the process as many times as are
300 L on each well. indicated in the kit´s instructions.
After the incubation periods, the washing steps must
Prior to emptying the content of the last
be done following the next instructions:
washing step, verify that the next reagent
to be added to the plate is ready to use. Do
Throw out the content of the plate by a brisk
not let the plate dry longer than strictly
turn over of the plate to avoid the possible
necessary.
mixture of the content from one well to another.
Dispense a volume of 300 L of washing After emptying the contents of the last
solution on each well. washing step, tap the plate turned over on
absorbent filter paper to remove the bulk of
Shake delicately the plate, avoiding the
the remaining washing solution.
contamination between wells.
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V. PREPARATION OF REAGENTS:
Washing solution:
Dilute one part of the concentrate washing Conjugate, Controls and Standards:
solution provided in the kit with 24 parts of They are supplied ready to use. Do not dilute.
distilled or deionized water. When ready, this Add 100 L of each solution directly to the
solution remains stable at +4°C, until the well.
expiration date of the kit.
Control Point
Dilution buffer: Dilute 1/20 with the Dilution Buffer (i.e. 25L
Dilute one part of the concentrate dilution + 475L of Dilution Buffer). Shake well before
buffer provided in the kit with 4 parts of use. Only prepare the necessary volume, as
distilled or deionized water. When ready, this the remaining volume should be discarded.
solution remains stable between +2ºC and
+8°C, until the expiration date of the kit.
VI. SAMPLES PREPARATION:
Extraction of Heat-processed products or Extraction of Non Heat-processed products
products containing Soya. and products non-containing Soya.
1. Weigh 0.25 g of a milled, food sample and
1. Weigh 0.25 g of a milled food sample and
place it in a 10 ml propylene tube. place it in a 10 ml propylene tube.
2. Add 10 ml of 60% ethanol and incubate
2. Add 2.5 mL of the Extraction buffer to the between 20 and 60 minutes at room
tube containing the sample. temperature with agitation.
3. Proceed to step 7 of the heat processed
3. Close the tube tightly and cover the cap with products extraction
parafilm to avoid evaporation.
4. Mix thoroughly by vortexing (5-10 seconds) Extraction of samples containing tannins or
and place the tubes in a rack. polyphenols (chocolate, red wine, fruit
juices…)
5. Incubate the tubes between 20 and 60 1. In a 10 mL propylene tube, weight 0.25 g of
minutes at room temperature. During this Gelatin and 0.1 g of Polyvinyl-pyrrolidone.
incubation period, vortex the sample 2-3 (Polyvinylpyrrolidone Sigma PVP-360) (Fish
times. Gelatine Sigma No. G-7041).
2. Weigh 0.25 g of the milled food sample and
6. Open the tubes, add 7.5 ml 80% ethanol,
add it to the tube.
thoroughly disperse the samples by vortexing
3. Add 2.5 mL of Extraction Buffer
10 to 60 seconds and incubate between 20
4. Close the tubes and seal them with parafilm in
and 60 minutes at room temperature with
order to avoid evaporation due to heat.
agitation (a rotatory shaker at 45 turns per
5. Mix by vortex until the sample is completely
minute is recommended).
mixed.
7. Centrifuge the tubes for 10 min at 2000- 6. Incubate tubes between 20 and 60 minutes at
2500 g at room temperature room temperature.
7. Add 7.5 mL of 80% Ethanol to the sample and
8. Take the supernatants with fresh Pasteur incubate between 20 and 60 minutes at room
pipettes and transfer to clean 10 mL temperature with agitation (a rotatory shaker
polypropylene tubes. The solution is now at 45 revolutions per minute is recommended).
ready for ELISA. 8. Centrifuge the samples 10 minutes at 2000-
2500 g at Room Temperature.
9. Collect the supernatant into clean 10 mL
propylene tubes.
10. These extracts should be stored at Room
Temperature
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reported considering the Limit of Detection of the
EXTRACTION OF SWAB SAMPLES assay (3ppm of Gluten).
IMPORTANT NOTE: this procedure can only be GENERAL INSTRUCTIONS
used for a qualitative detection of gluten The extracted samples may be kept 7 days at
(absence/presence) in a surface sample. room temperature (or 1 month at 4ºC), before
performing the ELISA test. While stored, close
Swab samples should not be used for tightly the vials with parafilm in order to avoid
quantification, as the initial amount of sample in evaporation.
the swab is unknown.
The samples should be diluted as follows
Considering that using a swab, only a little amount before adding to the ELISA plate wells:
of sample can be taken, the extraction procedure 1) Samples with estimated gluten contents
is similar to the “normal” one, but using less lower than 50 ppm: make dilutions 1:25
volume of Extraction Buffer and Ethanol (as long and 1:50, using the supplied diluent.
as the original proportion is maintained):
2) Samples with gluten contents between
50-100 ppm: make dilutions 1:50 and
1. Once the sample has been taken, cut the tip of
the swab and put it into a 10mL propylene tube. 1:100
2. Add 1mL of Extraction Buffer to the tube. 3) Samples with gluten contents between
3. Close the tube tightly with the cap and seal it 100-200 ppm: make dilutions 1:100-
using Parafilm in order to avoid evaporation. 1:200
4. Vortex for 5-10 seconds. 4) Samples with gluten contents between
5. Incubate between 20 and 60 minutes at room 200-300 ppm make dilutions 1:200 and
temperature. 1:400
6. Add 3mL of Ethanol (80%), vortex for 10-60 5) Samples with gluten contents between
seconds and incubate between 20 and 60 300-600 ppm make dilutions of 1:400
minutes at room temperature with agitation. and 1:800.
IMPORTANT: do not remove the swab from the
tube at this step. Dilution procedure:
7. Remove the swab after the incubation and use 1:25 = 960L of diluent+40L of sample
the solution for the ELISA (dilutions 1:12.5 and 1:50 = 980L of diluent+20L of sample
1:25). 1:100 = 990L of diluent+10L of sample
8. Compare the OD values of both dilutions with the 1:200 = 1,990L of diluent+10L of sample
OD of the lower standard, in order to have an 1:400 = 1,995L of diluent+5L of sample
idea about the absence/presence of Gluten on 1:800 = 3,995 L of diluent+5L of sample
the sample surface. The results should be
VII. TEST PROCEDURE:
1. All reagents must be allowed to come to room 6. Using a multi-channel pipette, add 100 L of
temperature before use (about 30 min.). TMB substrate to each well. Keep the plate for
10 min at room temperature
2. Add 100 L of controls and standard solutions
to duplicate wells. Add 100 L of samples 7. Add 100 L of stop solution to each well
(diluted as explained above), to the remaining following the substrate’s order of addition. A
wells. We recommend the use of two wells per positive reaction will change the colour from
diluted sample. Seal the plate and incubate 1 blue to yellow
h at room temperature (22-25°C).
8. Read the OD of each well at 450 nm within 5
3. Wash 3 times as specified in point IV (Washing min after the addiction of stop solution.
steps).
4. Using a multi-channel pipette, add 100 L of
specific conjugate to each well seal the plate
and incubate 1 h at room temperature
(22-25°C).
5. Wash 3 times as before.
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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VIII. READING AND INTERPRETATION OF THE RESULTS:
Validation of the test
The test could be considered valid when:
The OD of the Positive control is higher than OD of the 25ng/mL point and de OD of the Negative
Control is lower than the OD of the 1.56 ng/mL point.
Interpretation:
The OD of the sample will be calculated as the arithmetic mean of the duplicates OD values.
Enter on the x-axis the mean OD values obtained for the five standards and on the y-axis the
corresponding ng/ml values to represent the curve.
Sample gliadin concentration (C) should be obtained by interpolation of the OD value in the curve
standard.
Sample gluten content (ppm) will be calculated as follows:
ppm of gluten = C x D x 2 x 40 / 1000
where:
C: Gliadin concentration of the sample calculated from the calibration curve in ng/mL.
D: Dilution factor of the sample (25,50,100,etc)
2: Factor applied to express the results in gluten concentration
40: Dilution factor applied in the sample preparation (0.25g in 10 ml of extraction solution).
1/1000: Conversion from ng/mL to ppm
ADDITIONAL INFORMATION
In order to obtain correct values, the OD that the assay is properly working. It is not
values of the samples should be included necessary to use it, but it is recommended.
between the OD values of the standard Procedure for analyse the Control Point:
curve. If not, the assay should be repeated Dilute 1:20 with Dilution Buffer and add
using different dilutions of the samples. 100L into the correspondent well.
Just in case the OD value of the sample is The OD of this point should be similar to
slightly higher than the OD of the 25 ng/mL the OD of the 25ng/mL point, with a
point (up to 15%), the assay is valid. In deviation of ± 0.2
this case you have to include the positive Interpolating this OD value into the
control in the curve, as it corresponds to standard curve (for the determination of
50ng/ml of gliadin. the content of gluten), the final value
Control Point: This is an internal Control should be 40±8 ppm of Gluten.
Point included in the kit in order to assure
EXAMPLE:
ng/ml
30
1) OD of Positive Control = 1.82 25
25
2) OD of Negative Control = 0.13 20
15
3) OD of the standards points (concentration
10
is expressed in ng/mL of gliadin): 5
1,56
0
25 ng/mL = 1.44
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
12.5 ng/mL = 1.08
6.25 ng/mL = 0.73 Abs 450nm
3.12 ng/mL = 0.47
1.56 ng/mL = 0.32
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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4) Sample gliadin concentration (C) is obtained interpolating the sample OD value in the standard curve or using
the appropriate software. For example:
Software: Excel (Microsoft)
Once obtained the gliadin standards OD values, click on “Graphic assistant”
Select type of graphic: “XY (dispersion)
Click on graphic windows and select “ Add tendency line”
In label “type”, click on “polynomial”
In label “Options”, click on “ Present formula in the graphic”
In this formula, replace the unknown factor “x” by the sample OD value.
ng/ml
30
y = 15,154x 2 - 6,4417x + 2,4497 25
25
R2 = 0,9974
20
15
10
5
1,56
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Abs 450nm
Dilution ng/ml of ppm of Mean (ppm
Sample OD
(D) gliadin (C)* Gluten of Gluten)
1:25 0.31ITALIANO
SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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OVERVIEW OF PROCEDURE
1. Reagents must be equilibrated at room 7. Incubate at room temperature (22-
temperature (22-25ºC) before start. 25ºC) for 60 min.
2. Add 100L of sample (prepared and 8. Wash wells 3 times with diluted wash
diluted as described in point VI) in solution to remove un-reacted
duplicated wells. conjugate.
3. Add 100µL of standards and positive 9. Add 100µL of substrate (TMB) to each
control. Cover with adhesive foil. well.
4. Incubate at room temperature (22- 10. Incubate 10min at room temperature
25ºC) for 60 min.
11. Add 100µL of stop solution to each
5. Wash wells 3 times with diluted wash well.
solution to remove not bound reagents.
12. Read at 450nm.
6. Add 100µL of Mab Peroxidase
Conjugate to each well. Cover with
adhesive foil.
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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COMPOSIZIONE DEL KIT
1 piastra (8x12 pozzetti)
Reagente
Uni. Vol.
Piastra da microtitolazione (12x8 pozzetti) rivestita con anticorpo Mab
1
R5, specifico per gliadina, secalina e ordeina
1 1,5 mL
Controllo positivo pronto all’uso
Controllo negativo pronto all’uso 1 1,5 mL
Punto di controllo (concentrato 20 x) 1 250 µL
Provette contenenti standard europeo di gliadina a 25 ng/mL, 12,5
5 1,5 mL
ng/mL, 6,25 ng/mL, 3,12 ng/mL e 1,56 ng/mL pronte all’uso
Provette contenenti un anticorpo Mab R5 coniugato con perossidasi anti-
1 15 mL
gliadina, secalina e ordeina (pronte all’uso)
Bottiglia del tampone di estrazione (pronto all’uso) 1 110 mL
Bottiglia della soluzione di lavaggio concentrata 25 x 1 65 mL
Bottiglia del diluente (DE12-05) (concentrata 5 x) 1 65 mL
Bottiglia del substrato (TMB) 1 15 mL
Bottiglia della soluzione di stop ( H2SO4 0,5M) 1 15 mL
ALTRI MATERIALI E REAGENTI NECESSARI NON COMPRESI NEL KIT:
Etanolo
Acqua distillata
Il kit SENSISpec INgezim Gluten R5 ha ottenuto lo status di AOAC Research Institute Performance
Tested MethodsSM con assegnazione del certificato numero #052005, per impasti di pane senza glutine,
farina d'avena e superfici in acciaio inossidabile.
2ITALIANO
SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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I. PRINCIPIO DEL SAGGIO
Questo kit si basa su un saggio Questo Mab coniugato si legherà alle gliadine
immunoenzimatico a sandwich con doppio catturate e dopo una fase di lavaggio l'azione
anticorpo (DAS o capture Elisa). Di seguito della perossidasi sarà rilevata aggiungendo il
riportiamo una breve descrizione della tecnica: substrato TMB. Il cambiamento della soluzione del
La piastra è rivestita con l'anticorpo monoclonale substrato incolore in un prodotto blu e poi, dopo
R5 (Mab), che riconosce un epitopo comune a l'aggiunta della soluzione di stop, in un colore
gliadine, secaline e ordeine. Pertanto, quando un giallo può essere misurato con un lettore ELISA.
campione viene aggiunto nei pozzetti, il Mabs di Il contenuto di gliadina dei campioni sarà
cattura R5 si lega alle gliadine presenti in esso. determinato per estrapolazione del loro OD nella
Un secondo R5 Mab, coniugato con la perossidasi, curva di calibrazione fatta con lo standard di
viene aggiunto dopo una fase di lavaggio. gliadina fornito con il kit. La sensibilità del saggio
è di 3 ppm di glutine.
II. PRECAUZIONI ED AVVERTENZE PER L’UTILIZZATORE:
1. Leggere attentamente le istruzioni per 7. Non pipettare con la bocca.
l'uso. 8. Usare un nuovo puntale per ogni nuovo
2. Portare tutti i reagenti a temperatura campione.
ambiente (22°-25°C) prima dell'uso. 9. Includere i controlli e la curva standard
ogni volta che si esegue il test.
3. Non mescolare le istruzioni o i
10. IMPORTANTE Il substrato TMB deve
reagenti di kit diversi.
essere maneggiato con cura, è molto sensibile
4. Evitare qualsiasi contaminazione dei alla luce e alla contaminazione: pipettare una
reagenti del Kit. quantità sufficiente per il saggio dal flacone di
5. Non utilizzare i componenti dopo le stoccaggio del substrato in un contenitore
date di scadenza e non mescolare i separato scuro prima della fase di sviluppo del
componenti di lotti diversi. colore.
11. La soluzione di stop è un acido forte.
6. Non si deve mangiare, bere o fumare
dove si maneggiano i campioni o i Maneggiare con cura.
reagenti del Kit.
III. CONSERVAZIONE DELLE COMPONENTI DEL KIT:
Tutti i componenti devono essere conservati tra +2ºC e +8ºC. NON CONGELARE I
COMPONENTI DEL KIT.
Evitare l'esposizione del kit e dei componenti alla luce diretta del sole in qualsiasi momento,
poiché alcuni reagenti sono sensibili alla luce.
IV. INFORMAZIONI SULLA PROCEDURA DI LAVAGGIO:
Buttare il contenuto della piastra capovolgendo
Le fasi di lavaggio possono essere effettuate con una velocemente la piastra per evitare l'eventuale
spruzzetta, un lavatore automatico o una pipetta mescolanza del contenuto da un pozzetto
multicanale adatta a erogare 300 µL in ogni all'altro.
pozzetto. Dispensare un volume di 300 µL di soluzione di
Dopo i periodi di incubazione, le fasi di lavaggio lavaggio in ogni pozzetto.
devono essere eseguite seguendo le istruzioni Agitare delicatamente la piastra, evitando la
successive: contaminazione tra i pozzetti.
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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Non lasciare asciugare la piastra più a lungo del
Capovolgere velocemente la piastra per necessario.
svuotare i pozzetti. Dopo aver svuotato il contenuto dell'ultima fase
Ripetere la procedura tante volte quante sono di lavaggio, capovolgere la piastra su carta da
indicate nelle istruzioni del kit. filtro assorbente per rimuovere la maggior parte
Prima di svuotare il contenuto dell'ultima fase di della soluzione di lavaggio residua.
lavaggio, verificare che il reagente successivo
da aggiungere alla piastra sia pronto per l'uso.
V. PREPARAZIONE DEI REAGENTI:
Soluzione di lavaggio: Coniugato, controlli e standard:
Diluire una parte della soluzione di lavaggio Sono forniti pronti all'uso. Non diluire.
concentrata fornita nel kit con 24 parti di Aggiungere 100 L di ogni soluzione
acqua distillata o deionizzata. Quando è direttamente nel pozzetto.
pronta, questa soluzione rimane stabile a
+4°C, fino alla data di scadenza del kit. Punto di controllo
Diluire 1/20 con il tampone di diluizione (cioè
Tampone di diluizione: 25 L + 475 L di tampone di diluizione).
Diluire una parte del tampone di diluizione Agitare bene prima dell'uso. Preparare solo il
concentrato fornito nel kit con 4 parti di acqua volume necessario, poiché il volume rimanente
distillata o deionizzata. Quando è pronta, deve essere scartato.
questa soluzione rimane stabile tra +2ºC e
+8°C, fino alla data di scadenza del kit.
VI. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI:
Estrazione di prodotti trattati termicamente 8. Trasferire i surnatanti con le pipette Pasteur
o contenenti soia. pulite e trasferirli in tubi di polipropilene da
10 mL nuovi. La soluzione è ora pronta per
1. Pesare 0,25 g di un campione di cibo l'ELISA.
macinato e metterlo in un tubo di propilene
da 10 ml.
2. Aggiungere 2,5 mL di tampone di estrazione
nella provetta contenente il campione.
3. Chiudere bene la provetta e coprire il tappo
con parafilm per evitare l'evaporazione.
4. Mescolare accuratamente vortexando (5-10
secondi) e mettere le provette in un
portaprovette.
5. Incubare le provette tra 20 e 60 minuti a
temperatura ambiente. Durante questo
periodo di incubazione, vortexare il campione
2-3 volte.
6. Aprire le provette, aggiungere 7,5 ml di
etanolo all'80%, mescolare accuratamente i
campioni vortexando da 10 a 60 secondi e
incubare tra 20 e 60 minuti a temperatura
ambiente con agitazione (si consiglia un
agitatore rotatorio a 45 giri al minuto).
7. Centrifugare le provette per 10 minuti a
2000-2500 g a temperatura ambiente
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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Estrazione di prodotti non trattati tampone di estrazione e di etanolo (purché sia
termicamente e di prodotti non contenenti mantenuta la proporzione originale):
soia.
1. Una volta prelevato il campione, tagliare la
1. Pesare 0,25 g di un campione di cibo punta del tampone e metterlo in un tubo di
macinato e metterlo in un tubo di propilene propilene da 10 ml.
da 10 ml. 2. Aggiungere 1mL di tampone di estrazione
2. Aggiungere 10 ml di etanolo al 60% e alla provetta.
incubare tra 20 e 60 minuti a temperatura 3. Chiudere bene la provetta con il tappo e
ambiente con agitazione. sigillarla con Parafilm per evitare
3. Procedere alla fase 7 dell'estrazione dei l'evaporazione.
prodotti trattati termicamente 4. Vortexare per 5-10 secondi.
5. Incubare tra 20 e 60 minuti a temperatura
ambiente.
Estrazione di campioni contenenti tannini o
6. Aggiungere 3mL di Etanolo (80%), vortexare
polifenoli (cioccolato, vino rosso, succhi di
per 10-60 secondi e incubare tra 20 e 60
frutta...) minuti a temperatura ambiente con
1. In un tubo di propilene da 10 mL, pesare agitazione. IMPORTANTE: non rimuovere il
0,25 g di gelatina e 0,1 g di tampone dalla provetta in questa fase.
polivinilpirrolidone. (Polivinilpirrolidone Sigma 7. Rimuovere il tampone dopo l'incubazione e
PVP-360) (Gelatina di pesce Sigma n. G- utilizzare la soluzione per l'ELISA (diluizioni
7041). 1:12.5 e 1:25).
2. Pesare 0,25 g del campione di cibo macinato 8. Confrontare i valori di OD di entrambe le
e aggiungerlo alla provetta. diluizioni con l’OD dello standard inferiore,
3. Aggiungere 2,5 mL di tampone di estrazione per avere un'idea dell'assenza/presenza di
4. Chiudere i tubi e sigillarli con parafilm per glutine sul campione. I risultati devono
essere riportati considerando il limite di
evitare l'evaporazione dovuta al calore.
rilevazione del saggio (3 ppm di glutine).
5. Vortexare fino a quando il campione non è
completamente mescolato.
6. Incubare le provette tra 20 e 60 minuti a
temperatura ambiente. INDICAZIONI GENERALI
7. Aggiungere 7,5 mL di etanolo all'80% del I campioni estratti possono essere conservati 7
campione e incubare tra 20 e 60 minuti a giorni a temperatura ambiente (o 1 mese a 4ºC),
temperatura ambiente con agitazione (si prima di eseguire il test ELISA. Durante la
raccomanda un agitatore rotatorio a 45 giri al conservazione, chiudere ermeticamente le fiale con
minuto). parafilm per evitare l'evaporazione.
8. Centrifugare i campioni per 10 minuti a 2000-
2500 g a temperatura ambiente. I campioni devono essere diluiti come segue prima
9. Raccogliere il supernatante in provette pulite di essere aggiunti ai pozzetti della piastra ELISA:
di propilene da 10 mL. 1) Campioni con contenuto di glutine stimato
inferiore a 50 ppm: fare diluizioni 1:25 e
10. Questi estratti devono essere conservati a
1:50, utilizzando il diluente in dotazione.
temperatura ambiente
2) Campioni con contenuto di glutine compreso
tra 50-100 ppm: fare diluizioni 1:50 e 1:100
ESTRAZIONE DI CAMPIONI DA TAMPONE 3) Campioni con contenuto di glutine tra 100-
200 ppm: fare diluizioni 1:100-1:200
NOTA IMPORTANTE: questa procedura può 4) Campioni con contenuto di glutine tra 200-
essere utilizzata solo per un rilevamento 300 ppm fare diluizioni 1:200 e 1:400
qualitativo del glutine (assenza/presenza) in un 5) Campioni con contenuto di glutine tra 300-
campione ottenuto da superfici. 600 ppm fare diluizioni di 1:400 e 1:800.
Procedura di diluizione:
I campioni da tampone non devono essere
1:25 = 960L di diluente +40L di campione
utilizzati per la quantificazione, poiché la quantità
1:50 = 980L di diluente +20L di campione
iniziale di campione nel tampone è sconosciuta.
1:100 = 990L di diluente +10L di campione
1:200 = 1990L di diluente +10L di campione
Considerando che utilizzando un tampone si può
1:400 = 1995L di diluente +5L di campione
prelevare solo una piccola quantità di campione, la
1:800 = 3995 L di diluente +5L di campione
procedura di estrazione è simile a quella
"normale", ma utilizzando un volume minore di
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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VII. PROCEDURA DEL SAGGIO:
1. Tutti i reagenti devono essere lasciati a pozzetto. Conservare la piastra per 10
temperatura ambiente prima dell'uso (circa minuti a temperatura ambiente.
30 min.).
7. Aggiungere 100 L di soluzione di stop ad
2. Aggiungere 100 L di controlli e soluzioni ogni pozzetto seguendo l'ordine di aggiunta
standard in duplicato nei pozzetti. del substrato. Una reazione positiva
Aggiungere 100 L dei campioni (diluiti come cambierà il colore da blu a giallo.
spiegato sopra), ai restanti pozzetti. Si
8. Leggere l'OD di ogni pozzetto a 450 nm
consiglia l'uso di due pozzetti per ogni
entro 5 minuti dopo l'aggiunta della
campione diluito. Sigillare la piastra e
soluzione di stop.
incubare 1 h a temperatura ambiente
(22-25°C).
3. Lavare 3 volte come specificato al punto IV
(fasi di lavaggio).
4. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere
100 L di coniugato specifico ad ogni
pozzetto sigillare la piastra e incubare 1 h a
temperatura ambiente (22-25°C).
5. Lavare 3 volte come prima.
6. Utilizzando una pipetta multicanale,
aggiungere 100 L di substrato TMB ad ogni
VIII. LETTURA ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI:
Convalida del test
Il test può essere considerato valido quando:
L'OD del controllo positivo è superiore all'OD del punto 25ng/mL e l’OD del controllo negativo è
inferiore all'OD del punto 1,56 ng/mL.
Interpretazione:
L’OD del campione sarà calcolata come media aritmetica dei valori di OD dei duplicati.
Inserire sull'asse delle ascisse i valori medi di OD ottenuti per i cinque standard e sull'asse delle
ordinate i corrispondenti valori ng/ml per rappresentare la curva.
La concentrazione di gliadina del campione (C) deve essere ottenuta per interpolazione del valore OD
sulla curva standard.
Il contenuto di glutine del campione (ppm) sarà calcolato come segue:
ppm di glutine = C x D x 2 x 40 / 1000
dove:
C: concentrazione di gliadina del campione calcolata dalla curva di calibrazione in ng/mL.
D: Fattore di diluizione del campione (25,50,100,ecc.)
2: Fattore applicato per esprimere i risultati della concentrazione di glutine
40: Fattore di diluizione applicato nella preparazione del campione (0,25g in 10 ml di soluzione di
estrazione).
1/1000: Conversione da ng/mL a ppm
INFORMAZIONI AGGIUNTIVE
Per ottenere valori corretti, i valori OD dei
campioni devono essere inclusi tra i valori
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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OD della curva standard. In caso contrario, Procedura per l'analisi del Punto di
il saggio deve essere ripetuto utilizzando controllo:
diverse diluizioni dei campioni. Diluire 1:20 con il tampone di diluizione
Nel caso in cui il valore della OD del e aggiungere 100 L nel pozzetto
campione sia leggermente superiore alla corrispondente.
OD del punto 25 ng/mL (fino al 15%), il L'OD di questo punto dovrebbe essere
saggio è valido. In questo caso è necessario simile all'OD del punto 25ng/mL, con
includere il controllo positivo nella curva, in una deviazione di ± 0,2
quanto corrisponde a 50 ng/ml di gliadina. Interpolando questo valore di OD nella
Punto di controllo: Questo è un punto di curva standard (per la determinazione
controllo interno incluso nel kit per del contenuto di glutine), il valore finale
assicurare che il saggio funzioni dovrebbe essere di 40±8 ppm di glutine.
correttamente. Non è necessario utilizzarlo,
ma è raccomandato.
ESEMPIO:
ng/ml
30
1) OD del controllo positivo = 1,82 25
25
2) OD del controllo negativo = 0,13 20
3) OD dei punti standard (concentrazione 15
espressa in ng/mL di gliadina): 10
25 ng/mL = 1,44 5
12,5 ng/mL = 1,08 1,56
0
6,25 ng/mL = 0,73 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
3,12 ng/mL = 0,47
1,56 ng/mL = 0,32 Abs 450nm
4) La concentrazione di gliadina del campione (C) si ottiene interpolando il valore di OD del campione nella
curva standard o usando il software appropriato. Ad esempio:
Software: Excel (Microsoft)
Una volta ottenuti i valori OD degli standard di gliadina, cliccare su "Assistente grafico"
Selezionare il tipo di grafico: "XY (dispersione)
Cliccare sulle finestre grafiche e selezionare "Aggiungi linea di tendenza”
Nell'etichetta "tipo", cliccare su "polinomio”
Nell'etichetta "Opzioni", cliccare su "Presenta la formula nel grafico”
In questa formula, sostituire il fattore sconosciuto "x" con il valore OD del campione.
ng/ml
30
y = 15,154x 2 - 6,4417x + 2,4497 25
25
R2 = 0,9974
20
15
10
5
1,56
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Abs 450nm
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SENSISpec INgezim GLUTEN R5
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ng/ml di
Diluizione ppm di media (ppm
Campione OD gliadina
(D) glutine di glutine)
(C)*
1:25 0,31Sviluppato e prodotto in Spagna da:
Distribuito in Italia da:
INMUNOLOGIA Y GENETICA APLICADA, S.A.
Av. de la Institución Libre de Enseñanza, 39
28037- MADRID (SPAIN)
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