Aplicaciones de la NGS al Diagnóstico Genético: Exomas, paneles, genomas, Dr. Javier García-Planells - Genotipia
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Dr. Javier García-Planells
Chief Scientific Officer
javier.garcia@imegen.es
Aplicaciones de la NGS al Diagnóstico Genético:
Exomas, paneles, genomas,…
Esquema • El Diagnóstico Genético • Paneles y exomas dirigidos • Exoma clínico, Exoma completo y trios • Nuevos Retos y experiencias
Aplicaciones Clínicas de la Genética
Enfermedades Enfermedades Medicina de
hereditarias genéticas adquiridas precisión
Enfermedades Neoplasias
multifactoriales
Diagnóstico Usamos el estudio genético para detectar algo demostrado científicamente, tenemos evidencias Investigación Usamos el estudio genético para corroborar una hipótesis previa, seguimos el método científico
Investigación Genética Clínica
Revolución Genómica
Revolución Genómica 2003 2010 2015
Objetivos de una prueba diagnóstica
• Capacidad de detección de evidencias clínicas
Sensibilidad
• Capacidad de discriminación, evitar incertidumbre
Especificidad
• Que dé una respuesta concreta a la cuestión clínica
Utilidad Clínica
La NGS proporciona una gran millones de secuencias en un único ensayo Exceso de datos que dificulta la extracción de la información clínicamente útil
Soluciones al Exceso de datos
Secuenciación dirigida
• Limitar la información genómica analizadaSoluciones al Exceso de datos
• Limitar la información genómica analizada
• Desarrollo de herramientas informáticas que nos
permitan gestionar eficazmente los datos e informaciónSoluciones al Exceso de datos
Soluciones al Exceso de datos
Para limitar la información genómica necesitamos:
• Utilizar Sistemas de captura ’físicos’
• Utilizar filtros bioinformáticos
Nos muestran solo las regiones de interés (ROI: regions of interest)Secuenciación dirigida
PCR Hibridación
Estrategia similar a Sanger
Cobertura homogénea Efecto Manhattan
Control de la representatividad Regiones no capturadas
Mayor complejidad técnica Simplicidad técnica (diseño y librerías)Secuenciación dirigida
¿Qué información seleccionamos?
• Mutaciones conocidas
• Genes
• Exones de los genes
• Exones de los genes conocidosSecuenciación dirigida
¿Qué información seleccionamos?
• Mutaciones conocidas
Hay otras técnicas más económicas y precisas para el
análisis de mutacionesSecuenciación dirigida
¿Qué información seleccionamos?
• Genes cerca de 20.000 genes
“parte funcional del genoma”Secuenciación dirigida
¿Qué información seleccionamos?
• Genes cerca de 20.000 genes
“parte funcional del genoma”
• transcritos alternativos
• miRNA y non coding RNA
• Elementos reguladoresSecuenciación dirigida
¿Qué información seleccionamos?
• Mutaciones conocidas
• Genes
• Exones de los genes
• Exones de los genes conocidosSecuenciación dirigida Exones de genes Exoma
Análisis de Exomas
Conjunto de todas las regiones codificantes de todos
los genes (exones), regiones que codifican proteínas.
Unos 21000 genes
1,5% de la información
genómica total
85 % de las mutaciones
descritas en regiones
codificantesSecuenciación dirigida
¿Qué información seleccionamos?
• Mutaciones conocidas
• Genes
• Exones de los genes
• Exones de los genes conocidosSecuenciación dirigida
Exones de genes conocidos Exoma Clínico
Conocemos 3000 genes asociados a unos 4000 fenotipos Mendelianos
Chong et al 2015. Am J Hum Genet 97: 199–215Secuenciación dirigida Exones de genes conocidos Exoma Clínico
Análisis informático
Análisis Primario
Análisis Secundario
Análisis Terciario
Investigación vs DiagnosticoInterpretación
Experiencia en la interpretación
- Algoritmos, bases de datos, análisis in silico, …
- Manejo de las variantes de significado incierto
- Estudios de segregación
Guías y recomendaciones
- American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)
- Richards et al (2008). Genet Med 10: 294-300
- ACMG Recommendations for Reporting of Incidental Findings in
Clinical Exome and Genome Sequencing
- EuroGentestInterpretación
Experiencia en la interpretación
- Algoritmos, bases de datos, análisis in silico, …
- Manejo de las variantes de significado incierto
- Estudios de segregación
Guías y recomendaciones
- American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)
- Richards et al (2008). Genet Med 10: 294-300
- ACMG Recommendations for Reporting of Incidental Findings in
Clinical Exome and Genome Sequencing
- EuroGentestInforme
Aplicación Clínica de la NGS Distintas estrategias para situaciones diferentes
Aplicación Clínica de la NGS
Paneles de alta precisión NextGeneDx®
Características Máxima precisión diagnóstica
- Máxima precisión diagnóstica
- Diseño específico basado en PCR
- Procedimiento validado
- Representatividad 100% de las ROIs
- Profundidad > 100X
- Número mínimo de VUS
Indicaciones
Siempre que se requiera una alta precisión diagnóstica
Sospecha clínica de una enfermedad asociada a genes de gran tamaño o grupo de genes
concreto
Enfermedades con heterogeneidad genética
Enfermedades de difícil diagnóstico diferencial o con características clínicas solapantesAplicación Clínica de la NGS
EXOMAS DIRIGIDOS
Características Alto rendimiento clínico
- Alto rendimiento de datos
- Elevado número de genes asociados con el fenotipo clínico
- Representatividad >95% de las ROIs
- Profundidad media > 50X
- Presencia de VUS
- Capacidad de descubrir
Indicaciones
Fenotipo clínico característico
Enfermedades con una heterogeneidad genética media o grande
Enfermedades que comparten una característica común (p.ej. sorderas, epilepsias,…)
Pacientes en los que se observe la presencia de más de un fenotipo característico
Enfermedades de difícil diagnóstico diferencial o con características clínicas solapantes
Diseño personalizadoAplicación Clínica de la NGS EXOMAS DIRIGIDOS Ataxias hereditarias 44 Hipoacusia 131 Autismo 98 Hipoacusia Autosomica Dominante 35 Canalopatias 93 Hipoacusia Autosomica Recesiva 54 Canalopatias Cardiacas 19 Hipoacusia Ligada al X 4 Canalopatias del Sistema nervioso 54 Hipoacusia No Sindromica 106 Canalopatias Endocrinas 5 Migraña 18 Canalopatias Renales 9 Deficiencia de los complejos mitocondriales 18 Distrofias Musculares 34 Paraparesias Espásticas 65 Distrofia Muscular Congenita 20 Paraparesia Espastica Recesiva 44 Distrofia de Cinturas 22 Paraparesia Espastica Dominante 18 Distonia Miotonica 14 Miopatia Congenita 142 Epilepsias 116 Miopatia Esqueletica 28 Epilepsia Mioclonica Juvenil 6 Miopatia Mitocondrial 208 Epilepsia Mioclonica Progresiva 8 Miopatia Nemalinica 7 Epilepsia Temprana 19 Noonan y Noonan-like 11 Charcot-Marie-Tooth 56 Parkinson 17 Miastenia Congenita 16 Retinosis Pigmentosa y Amaurosis Congenita de Leber 66 Cardio-Facio-Cutaneo 11 Retraso Mental 128
Aplicación Clínica de la NGS
EXOMA CLÍNICO
Todos los genes OMIM
Características
- Alto rendimiento de datos
- Todos los genes asociados a un fenotipo OMIM (> 4800)
- Profundidad media > 50X
- Alto número de VUS
- Capacidad de descubrir
Indicaciones
Formas sindrómicas inespecíficas o con fenotipos no característicos (p.ej, autismo, retraso
mental,...)
Enfermedades con una gran heterogeneidad genética
Sospecha de una alta frecuencia de mutaciones de novo. En estos casos se recomienda el
uso de tríos (paciente, padre y madre)
Pacientes en los que se observe la presencia de más de un fenotipo característico
Enfermedades de difícil diagnóstico diferencial o con características clínicas solapantes
Casos genéticos en los que todas las pruebas genéticas disponibles hayan resultado
negativasAplicación Clínica de la NGS
EXOMA COMPLETO
Todos los genes
Objetivo
- Identificar mutaciones en genes conocidos (= Exoma Clínico)
- Identificar mutaciones de novo
- Identificar mutaciones recesivas
- Incvestigación
Carácterísticas
Necesidad de analizar la muestra por tríos (paciente, padre y madre)
El análisis bioinformático puede resultar más eficaz (segregación)
Las conclusiones clínicas se van a poder tomar sobre variantes de significatividad clínica
conocida o genes conocidos (Exoma Clínico)
Alto número de variantes de significado incierto (VUS), tanto en genes conocidos como en
genes de significado incierto (GUS). El estudio de segregación proporciona mayor
capacidad interpretativaAplicación Clínica de la NGS
GENOMA COMPLETO
Todos el Genoma
Objetivo
- Identificar mutaciones en genes conocidos (= Exoma Clínico)
- Identificar mutaciones de novo
- Identificar mutaciones recesivas
- Investigación
Carácterísticas
Necesidad de analizar la muestra por tríos (paciente, padre y madre)
El análisis bioinformático puede resultar más eficaz (segregación)
Las conclusiones clínicas se van a poder tomar sobre variantes de significatividad clínica
conocida o genes conocidos (Exoma Clínico)
Alto número de variantes de significado incierto (VUS), tanto en genes conocidos como en
genes de significado incierto (GUS). El estudio de segregación proporciona mayor
capacidad interpretativa
Gran cantidad de datos que pueden ser procesados cuando se dispongan de herramientas
genómicas más precisasNuevos Retos
Nuevos Retos, nuevas historias De lo monogénico a lo multigénico En busca de “El Test Genómico” De la secuencia de ADN a la información clínica
De lo monogénico a lo multigénico • Fenotipos multigénicos • Fenotipos poligénicos • Genes con varios fenotipos • Pacientes con varias enfermedades
De lo monogénico a lo multigénico Fenotipos multigénicos
De lo monogénico a lo multigénico
Chong et al 2015. Am J Hum Genet 97: 199–215De lo monogénico a lo multigénico Genes con varios fenotipos
De lo monogénico a lo multigénico
Pacientes con varias enfermedades
5% de casos complejos analizados mediante exoma tienen
mutaciones asociadas a 2 enfermedades distintas
Ada Hamosh. Johns Hopkins University, USAEn busca de “El Test Genómico” Test Genómico que permita identificar el mayor número de eventos mutacionales asociados a un fenotipo determinado - SNPs y mutaciones en la secuencia - Variaciones en el número de copias - Perfiles de expresión - Alteraciones epigenéticas - ….
En busca de “El Test Genómico”
De la secuencia de ADN
a la información clínica
Conocemos 3000 genes asociados a unos 4000 fenotipos Mendelianos
Chong et al 2015. Am J Hum Genet 97: 199–215De la secuencia de ADN
a la información clínicaDe la secuencia de ADN
a la información clínica
1. Nomenclatura estándar
HGVS y MutalyzerDe la secuencia de ADN
a la información clínica
1. Nomenclatura estándar
HGVS y Mutalyzer
Genomas de referencia (hg18, hg19,…) ¡Ojo con las actualizaciones!!
Secuencias de referencia NG_XXXXXX.x
Transcritos de referencia NM_XXXXXX.xDe la secuencia de ADN
a la información clínica
1. Nomenclatura estándar
2. Clasificación de variantes
5 categorías:
- patogénica
- probablemente patogénica (>90%)
- variante de significado incierto (VUS, VOUS,…)
- probablemente benigna (>90%)
- benigna
Atención
Todas las bases de datos contienen errores de clasificación
Un 20 % de las variantes están siendo reclasificadasDe la secuencia de ADN
a la información clínica
1. Nomenclatura estándar
2. Clasificación de variantes
5 categorías:
- patogénica
- probablemente patogénica (>90%)
- variante de significado incierto (VUS, VOUS,…)
- probablemente benigna (>90%)
- benigna
Las acciones clínicas de un test genético son responsabilidad médica
Dependerán del contexto clínico, evidencias y otras pruebas
complementarias, no solo del resultado genéticoDe la secuencia de ADN
a la información clínica
1. Nomenclatura estándar
2. Clasificación de variantes
3. Interpretación de las variantes de significado incierto
Asignación de criterios de evidencia de acuerdo a las
recomendaciones
Uso de software de predicción como apoyo
Precisión del 65-80%
Toma de muestras de ambos padres siempre que sea posibleDe la secuencia de ADN
a la información clínica
1. Nomenclatura estándar
2. Clasificación de variantes
3. Interpretación de las variantes de significado incierto
4. Anotación y validación clínica
Incorporación de los resultados a bases de datos en las que se
incluya la clasificación, datos clínicos, frecuencias alélicas, étc, de
todas las variantes analizadasDe la secuencia de ADN
a la información clínica
1. Nomenclatura estándar
2. Clasificación de variantes
3. Interpretación de las variantes de significado incierto
4. Anotación y validación clínica
5. Gestión de la información, almacenamiento y reanálisis
6. Información al pacienteENSEÑANZAS Y CONCLUSIONES
1. La orientación clínica y un planteamiento correcto resultan esenciales
2. La NGS nos proporciona mayor potencia diagnóstica para resolver
casos complejos o enfermedades genéticamente heterogéneas
3. La NGS nos ahorra costes y tiempo
4. La interpretación es compleja y genera con frecuencia incertidumbre
diagnóstica
5. Importancia de la gestión de la información
6. Importancia de la calidad de la interpretación
7. Importancia de la segregación
8. Importancia de la orientación clínica post test (confirmación,
reevaluación, reorientación, seguimiento,…)
9. Importancia del asesoramiento genéticoInstituto de Medicina Genómica SL Agustín Escardino 9, Parc Científic de la Universitat de València 46980 Paterna (Valencia, España) +34 963 212 340 Muchas gracias Imegen.es
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