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CAPÍTULO XXVI
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE ABSORCIÓN DE
POLÍMEROS HIDROGELES SINTETIZADOS DESDE
BIOPOLIÉSTERES. IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
CON POTENCIAL PARA SU DEGRADACIÓN
Kirsty González
Lcdo. Química. Universidad de Oriente. Estudiante Postgrado Maestría en
Química. Cumaná, Venezuela. Orcid: https://0000-0002-6522-4246. Correo
electrónico: kirstydelvgonzalezv@gmail.com
Blanca Rojas de Gascue
Dra. en Química, Ing. de Materiales. Universidad de Oriente, Instituto de
Investigaciones en Biomedicina y Ciencias Aplicadas (IIBCAUDO), Cumaná,
Venezuela. Orcid: https://0000-0002-6053-7665. Correo electrónico: blanca_
gascue@yahoo.com
Pedro López Guaimacuto
MSc. Biología Aplicada. Universidad de Oriente, Centro Regional de
Investigaciones Ambientales (CRIAUDO), Nueva Esparta, Venezuela. Orcid:
https://0000-0001-6620-4549. Correo electrónico: pedro.lopez@ne.udo.edu.ve
Resumen
Se sintetizaron polímeros hidrogeles interpenetrando poliacrilamida (PAAm) con
polímeros naturales de tipo polihidroxialcanoatos (PHAs), los biopoliesteres: poli(3-
hidroxibutirato) (PHB) y poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV). El
objetivo de esta investigación fue evaluar los hidrogeles mediante su capacidad de
absorción, e inocularlos con un afluente de agua residual para identificar las bacterias
capaces de degradarlos. Los resultados mostraron que el porcentaje de hidratación
en los hidrogeles semi-interpenetrados (semi-IPN) de PAAm/PHB y de PAAm/
PHBV tuvieron un aumento considerable en comparación con el hidrogel sintético de
poliacrilamida, elevándose desde 824% para la poliacrilamida, hasta 2338% para el
PAAm/PHB, y 2320% para el de PAAm/PHBV, siguiendo una cinética de absorción
de segundo orden. Sus constantes cinéticas (contenido de agua en el equilibrio (m∞)
y constante de rapidez de absorción (k)) resultaron similares para las mezclas con los
biopoliesteres pero significativamente diferentes a los valores del hidrogel sintético de
PAAm. Finalmente, se confirmó la presencia de bacterias degradadoras en los medios
de cultivos de los hidrogeles semi-IPN las cuales se identificaron como Pseudomonas
aeruginosa y Pseudomonas fluorecescens.
www.doi.org/10.47212/tendencias2020vol.xii.27
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Volumen XII DESDE BIOPOLIÉSTERES.IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL PARA SU DEGRADACIÓN
Palabras claves: absorción, bacterias degradadoras, bioplásticos, hidrogeles, poliésteres
biodegradables
BIODEGRADATION STUDY IN SYNTHESIZED
HYDROGEL POLYMERS FROM BIOPOLIESTERS
WHEN INOCULATED WITH RESIDUAL WATER FLOW
Abstract
Hydrogel polymers were synthesized by interpenetrating polyacrylamide (PAAm)
with natural polymers of the PHAs polyhydroxyalkanoate, the biopolyesters: (poly3-
hydroxybutyrate (PHB) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV).
The objective of this research was to evaluate hydrogels by their absorption capacity,
and inoculate them with a wastewater effluent to identify bacteria capable of degrading
them. The results showed that the percentage of hydration in the semi-interpenetrated
hydrogels of PAAm/PHB and PAAm/PHBV had a considerable increase compared to
synthetic polyacrylamide hydrogel, rising from 824% for polyacrylamide, to 2338%
for PAAm/PHB, and 2320% for PAAm/PHBV, following a second order absorption
kinetics. Their kinetic constants (water content at equilibrium (m∞) and absorption
rate constant (k)) were similar for blends with biopolyesters but significantly different
from the values of the synthetic hydrogel of PAAm. Finally, the presence of degrading
bacteria was confirmed in the culture media of the semi-IPN hydrogels, which were
identified as Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorecescens.
Keywords: absorption, biodegradable polyesters, bioplastics, degrading bacteria,
hydrogels.
Proyecto de investigación
Proyecto de apoyo a la Salud IIBCAUDO (Instituto de Investigaciones en
Biomedicina y Ciencias Aplicadas de la Universidad de Oriente) y el Servicio de
Traumatología del HUAPA (Hospital Universitario Antonio Patricio de Alcalá) en
Cumaná, Venezuela.
Introducción
La biodegradabilidad es una variable determinante en el comportamiento ambiental
de las sustancias químicas y una propiedad deseable de los productos desechables.
Durante los últimos años, uno de los campos de aplicación en las investigaciones en
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materiales desechables se ha orientado al desarrollo de polímeros de tipo hidrogeles
como potenciales remediadores de sistemas contaminados (Zerpa et al., 2017), debido a
que las diferentes fuentes de contaminación, como los fluidos hospitalarios o el vertido
de aguas residuales industriales, entre otros, son considerados los principales agentes
acuosos de contaminación ambiental.
Ante esta problemática, en este trabajo se sintetizaron hidrogeles a partir de
biopoliésteres de polihidroxialcanoatos (PHAs) (Guzmán et al., 2017) y se caracterizaron
comparándolos con uno de los hidrogeles sintéticos más comunes, el hidrogel de
poliacrilamida (PAAm).
Conocer la capacidad de absorber y retener líquidos es uno de los aspectos más
importantes de este tipo de polímeros (Benítez et al., 2018) debido a que su síntesis y
caracterización extiende el campo de aplicación de los nuevos materiales en áreas de
fármacos, agronomía, apósitos entre otros (Alcívar, 2020), donde se requiere absorber y
liberar sustancias como antibióticos, fertilizantes y pesticidas entre otros.
Es importante también conocer cuales microorganismos son capaces de degradar el
material, para que los hidrogeles puedan ser sometidos, posteriormente a su aplicación,
a un medio que favorezca su biodegradación.
Este trabajo tiene como propósito llevar a cabo la síntesis de hidrogeles a partir de
poliacrilamida e interpenetrados con los biopoliésteres PHB y PHBV con el objetivo
de evaluar la capacidad de absorción y de aislar e identificar cepas bacterianas con
potencial para su degradación.
Fundamentos teóricos
Las principales vías de degradación de los polímeros son: enzimática, hidrolítica y
oxidativa. Las dos primeras suelen estar presentes en el proceso de biodegradación. Así
por ejemplo, la celulosa y el almidón son degradados por grupos específicos de enzimas
conocidas como celulasas y amilasas, respectivamente (Cruz et al., 2019). Por otra
parte, el contacto continuo con moléculas de agua favorece la degradación hidrolítica,
entonces es bien sabido que el enlace éter es mucho más resistente a la hidrólisis que uno
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de éster, y que la hidrólisis del grupo amida da lugar a una amina y un ácido carboxílico,
lo que es extensivo a las macromoléculas (Catalán et al, 2017).
Los polímeros biodegradables son obtenidos usualmente por vía fermentativa y se les
denomina también biopolímeros (Alcívar, 2020). Como ejemplos, el poli (ácido láctico)
PLA (Medina et al., 2018), y los biopoliésteres, como el poli (3-hidroxibutirato) PHB o
copolímeros del tipo poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) P(HBV) (González et
al., 2018), utilizados en este trabajo.
El PHB ha sido uno de los biopoliésteres más investigados, es producido por muchas
bacterias como medio para almacenar carbono y energía (Lenz y Marchessault, 2005).
Este polímero puede biodegradarse en entornos tanto aerobios como anaerobios, sin
formar productos tóxicos (Rojas et al., 2018). La mayoría de las cepas que son capaces
de degradar PHB pertenecen a diferentes grupos taxonómicos tales como bacterias
grampositivas y gramnegativas, Streptomyces y hongos (Lemos et al., 2015). El PHB,
al igual que su copolímero PHBV, son polímeros biodegradables y biocompatibles, sin
embargo, su aplicación se ha limitado debido a su alto costo de producción y a sus
propiedades mecánicas (Lenz y Marchessault, 2005).
Se han investigado diferentes sistemas y reacciones químicas con el PHB, que
permitieran proponer mejoras en sus potenciales aplicaciones. En mezclas con
polipropileno funcionalizado, habiendo hidrolizado previamente el PHB se detectaron
nuevas interacciones (Rojas et al., 2011). En este trabajo se reporta también el estudio
de la degradabilidad del PHB en sedimentos tomados de la Laguna La Restinga (Nueva
Esparta, Venezuela).
Muchos son los trabajos realizados a partir de estos polímeros, González et al.
(2018), por ejemplo, evaluaron las propiedades de absorción de hidrogeles semi-IPN
obtenidos a partir de acrilamida (AAm) y el biopoliester PHBV, utilizando 2,2-azobis(2-
metilpropionitrilo) (AIBN) como iniciador en una mezcla dimetilsulfóxido (DMSO)/
agua. Vale recordar que los hidrogeles se forman por entrecruzamiento, ya sea físico
o químico, con sus redes interpenetradas tridimensionales capaces de retener grandes
cantidades de agua y al mismo tiempo mantener su forma. Las características de los
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monómeros que lo forman y el grado de entrecruzamiento determinan las propiedades de
hinchamiento del hidrogel seco (xerogel) y, por tanto, su campo de aplicación (Ramírez
et al., 2016).
Los resultados reportados por González et al. (2018) indicaron la incorporación
efectiva del PHBV dentro de la red entrecruzada de la PAAm, determinando los
mecanismos de transporte de agua. Los valores obtenidos mostraron que el proceso de
difusión es menos Fickiano, lo que significa que la rapidez de penetración del agua era
mucho menor que la velocidad de relajación de las cadenas de polímero.
En otros sistemas Benítez et al. (2018) prepararon un hidrogel basado en AAm.
El artículo de Benítez señala que prepararon un hidrogel basado en AAm/anhídrido
maleico (AHM) en las mismas condiciones que hidrogeles basados en AAm/ácido
fumárico (AF)/ácido maleico (AM), con diferentes proporciones AF/AM. Mediante
espectroscopia de FTIR establecieron que las unidades de AHM incorporadas a las
cadenas poliméricas se hidrolizaron completamente durante la preparación del hidrogel.
Metodologia
Materiales
Para sintetizar los hidrogeles se empleó acrilamida (Promega, M:71,08 g/mol), NN’-
metilenbisacrilamida (NNMBA) (Riedel-De Haën, M:154,17 g/mol al 98%) y persulfato
de amonio (Riedel-De Haën, M:228,20 g/mol al 98%). El poli (3-hidroxibutirato) y
el poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) fueron suministrados por Copersucar
(Brasil).
Síntesis de los hidrogeles
Los hidrogeles se sintetizaron de acuerdo a las proporciones encontradas en la tabla
1. En el hidrogel de PAAm se disolvió la acrilamida en agua desionizada, luego se
agregó el agente entrecruzante (NNMBA) se agitó y se dejó reposar por 20 min. Se
disolvió el iniciador y se agregó a la mezcla AAm y entrecruzante. Posteriormente, se
colocó el tubo de ensayo en un baño de aceite a 60°C durante 1 hora. Al iniciar el
calentamiento se purgó la mezcla con nitrógeno, luego se selló el tubo hasta que se
completara el tiempo de reacción (Ramírez et al., 2016).
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Tabla 1
Cantidad (g) de los reactivos utilizados para la síntesis de hidrogeles
PAAm PAAm/ PHB PAAm/ PHBV
PHB - 0,20 -
PHBV - - 0,20
Acrilamida 2,01 1,80 1,80
Entrecruzante 0,02 0,02 0,02
Iniciador 0,01 0,01 0,01
Para sintetizar los hidrogeles semi-IPN PAAm/PHB y PAAm/ PHBV, se realizó de
forma análoga al procedimiento anterior, sin embargo el PHB y el PHBV se disolvieron
previamente con ácido acético glacial en un baño de aceite a 100°C. Una vez disueltos
se añadieron a la mezcla AAm y NNMBA, y se agitaron constantemente hasta obtener
una mezcla homogénea a la cual se les agregó el iniciador disuelto previamente en agua
desionizada. De igual forma, que en la síntesis anterior se purgó la mezcla con nitrógeno
por 5 min y se dejó reaccionar por 1 hora a 60°C.
Una vez obtenidos los hidrogeles se extrajeron del tubo de ensayo y se cortaron con
un hilo de Nylon en forma de discos, se lavaron con agua desionizada durante 7 días y se
dejaron secar a temperatura ambiente hasta alcanzar su estado seco de Xerogel.
Capacidad de absorción (grado de hinchamiento)
La capacidad de absorción de agua de los hidrogeles es una de sus características
más importantes, ya que a partir de ella se puede determinar su aplicabilidad, puesto que
controla gran número de sus propiedades como son la permeabilidad, las propiedades
mecánicas y superficiales, y se caracteriza mediante el porcentaje de hidratación o índice
de hinchamiento (H%) (Ramírez et al., 2016).
Esta capacidad se determinó gravimétricamente, sumergiendo el xerogel
(0,1±0,001g) en agua desionizada a temperatura ambiente. Al cabo de 5 min se extrajo
el gel, se secó con papel de filtro, se pesó y se colocó nuevamente en agua desionizada.
Este procedimiento se repitió a diferentes tiempos hasta que el hidrogel alcanzó el
equilibrio fisicoquímico. Tomando en cuenta la masa se construyeron las isotermas de
absorción para los diferentes hidrogeles utilizando la siguiente ecuación:
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(1)
Dónde: (H%): porcentaje de hidratación, m: es la masa del hidrogel a un tiempo t, y
mo: es la masa del hidrogel seco (xerogel). Para determinar la cinética de hinchamiento
se utilizó la ecuación de Schott (1992), la cual es útil para experimentos cuya data de
absorción se refieren a largos periodos de tiempo o altos grados de hinchamiento. Las
medidas se realizaron por triplicado.
Estudio de biodegradación e identificación de microorganismos
Para el estudio de biodegradación se utilizó un medio de sales minerales, el cual
se optimizó a partir del medio reportado por Shah et al., (2008), después de pruebas
realizadas considerando la revisión reportada por López (2012). El medio se preparó
a partir de: KH2PO4 (0,7g), K2HPO4 (0,7g), MgSO4.7H2O (0,7g), NH4Cl (1,0g),
FeSO4.7H2O (0,003g), MnSO4.H2O (0,003g), CaCl2.2H2O (1,671g) y CuCl2.2H2O
(0,160g), disueltos en 1L de agua destilada. El medio fue esterilizado a través de
filtración por membrana. Se tomaron 100 mL de esta solución y se colocaron en un
recipiente donde posteriormente se colocó cada hidrogel, luego se introdujo un filtro
de membrana de acetato de celulosa (0,45 µm de diámetro de los poros) por el cual
previamente se hizo pasar 1 mL de un agua residual proveniente del afluente de un Hotel
local. Se incubaron los hidrogeles por 2 semanas a 30ºC, este procedimiento se realizó
por duplicado. Para el control se utilizó el mismo procedimiento con la diferencia que
no se introdujo ninguna membrana con la retención microbiana en el medio mineral con
el hidrogel.
Para la identificación de microorganismos con potencial para la degradación de
biopolímeros, se sembró por estriado de los cultivos (experimental y control) de los
hidrogeles en placas de agar Cromocult (Merck) y Pseudomonas (Hi-Media) que se
incubaron a 30 oC durante 48 h. Posteriormente se re-aislaron las bacterias en caldo
Fluorocult y luego se observaron bajo la luz ultravioleta.
Resultados y discusión
Capacidad de absorción (grado de hinchamiento)
El grado de hidratación del hidrogel de poliacrilamida fue de 824% en un tiempo
de 8640 min manteniéndose constante. Por otra parte, los hidrogeles Poli (AAm)/PHB
y Poli(AAm)/PHBV tuvieron grados de hinchamiento similares correspondientes a los
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valores en masa alcanzados de 2,132 g y 2,063 g respectivamente. Estas diferencias en
la masa son significativas, ya que se indicó anteriormente que las medidas se realizaron
por triplicado, a partir de lo cual se determinó la desviación estándar en cada caso que
resultó entre 0,0006 g y 0,0052 g. Sus capacidades máximas de absorción la alcanzaron
los hidrogeles después de 54720 min (38 días), los cuales fueron de 2338 % para una
masa de 2,536 g de Poli (AAm)/PHB y de 2320 % para una masa de 2,396 g del Poli
(AAm)/ PHBV. Los hidrogeles hinchados se pueden observar en la figura 1a, y sus
respectivas masas medidas a los 38 días se ilustran en la figura 1b.
Figura 1
(a) Hidrogeles hidratados de poliacrilamida (PAAm) y de los semi-interpenetrados
con polímeros naturales: poli (3-hidroxibutirato) PHB y poli (3-hidroxibutirato-co-3-
hidroxivalerato) PHBV. (b) Masas medidas después de 38 días, incremento registrado a
partir de una masa inicial de 0,1 g.
(a)
0
Masa de hidrogel (g)
(b)
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En la figura 2, se muestran las isotermas de hinchamiento de los hidrogeles, obtenidas
a partir de la ecuación 1. En ellas se puede notar la mayor capacidad de absorción que tienen
los hidrogeles semi-IPN con los poliésteres, en comparación con el de poliacrilamida,
se postula que es debido al incremento de volumen libre y grupos esteres que aportan
las moléculas de los PHAs durante la síntesis de la red interpenetrada, favoreciendo la
formación de puentes de hidrógeno con el agua. Estos resultados coinciden con trabajos
previos reportados en hidrogeles sintetizados con sistemas análogos (Villarroel et al.,
2010), y en sistemas similares pero con otros biomateriales como el Quitosano (Q),
formando redes semi-interpenetradas Poli (AAm)/ Q (Rojas et al., 2012 ).
No obstante, la tendencia en los grados de hinchamiento difieren de trabajos previos
reportados en sistemas similares de Poli (AAm)/ PHBV por González et al. (2013),
estas diferencias podrían tener su origen en el tipo de solvente empleado por estos
investigadores, quienes utilizaron dimetilsufóxido (DMSO), indicando en sus resultados
que el DMSO tuvo un efecto plastificante en los geles, transformándolos en películas, de
baja capacidad de absorción.
En la ampliación (figura 2c) se observó como en las primeras 3h el hidrogel de
poliacrilamida inicialmente tenía un porcentaje de hidratación mayor que los hidrogeles
con PHAs, sin embargo, en el lapso de tiempo de 180-1440 minutos (3h a 24h) comenzó
a disminuir, como se observa en la figura 2b.
Figura 2
Isotermas de absorción o hinchamiento de los hidrogeles de poliacrilamida (PAAm)
y de los semi-IPN con polímeros naturales: poli (3-hidroxibutirato) (PHB) y poli
(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato), (PHBV). (a) Hasta 55.000 min (38 días). (b)
Hasta 1440 min (las primeras 24 h) (c) Hasta 180 min (Las primeras 3h).
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En cuanto al estudio cinético de absorción de los hidrogeles determinado por la
ecuación de Schott, el mismo confirmó que los hidrogeles semi-IPN poli (AAm)/PHB
y poli (AAm)/ PHBV, arrojaron un mayor contenido de agua en el equilibrio (m∞). No
obstante, resultaron con una disminución significativa en la constante de rapidez de
absorción (k) comparados con el hidrogel de poliacrilamida. Resultados previos, han
reportado que una mayor cantidad de enlaces de hidrógeno en el estado xerogel, retardan
la difusión de los líquidos (Benítez et al., 2015).
Estudio de biodegradación e identificación de microorganismos
Luego de 2 semanas de incubación se observó que en los hidrogeles semi-IPN
sumergidos en medio mineral e inoculados con microorganismos de afluentes de aguas
residuales retenidos en membranas de nitrocelulosa (cultivos experimentales) y los
controles (hidrogeles no inoculados) presentaron cierta turbidez, indicando posible
crecimiento microbiano (figura 3A), lo cual se confirmó al realizar el sembrado en
placas de agar Cromocult y Pseudomonas, donde se observaron colonias productoras de
un pigmento pardo en el agar Cromocult y colonias transparentes a blanquecinas en el
agar Pseudomonas (figura 3B).
Al ser re-aisladas en caldo Fluorocult las cepas provenientes del agar Cromocult
mostraron la presencia de un pigmento pardo y las procedentes del agar Pseudomonas la
producción de un pigmento verdoso que mostró fluorescencia a la luz ultravioleta. Estos
cambios permitieron identificar las cepas degradadoras como Pseudomonas aeruginosa
(agar Cromocult) y Pseudomonas fluorecescens (agar Pseudomonas).
Finalmente, hay que destacar que en las fotografías de las placas de Petri se observó el
desarrollo de colonias tanto en los estriados tomados del medio mineral con hidrogeles y
membrana, como en el control sin membrana. Se esperaba que en los cultivos controles (sin
inoculo bacteriano proveniente del afluente) no debian desarrollarse microorganismos,
por lo que se infiere que hubo contaminación por bacterias del ambiente. A pesar de
que todo fue cuidadosamente esterilizado (medio mineral, recipientes e instrumentación
utilizados), pero es posible que haya que optimizar el cierre de los recipientes.
473Tendencias en la Investigación Universitaria
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Figura 3
(A) Turbidez del medio de cultivo donde se encuentran los hidrogeles a) poli(AAm)/
PHB b) poli(AAm)/ PHBV. (B) Crecimiento de microorganismos en placas de Agar. (a)
Agar Cromocult con cultivo poli(AAm)/PHB (b)Agar Cromocult con cultivo poli(AAm)/
PHBV. c)Agar Pseudomona con cultivo Poli(AAm)/PHB d)Agar Pseudomona con
cultivo poli(AAm)/PHBV
(A)
(B)
Otro aspecto que será revisado en futuros trabajos es la síntesis y la purificación de
los hidrogeles (figura 4), ya que en aplicaciones biomédicas de estos materiales Moreno
et al. (2016), han reportado que a pesar del secado y esterilización de los hidrogeles, se
ha encontrado en ellos, trazas de agentes pirogénicos que quedan ocluidos, y que pueden
derivar en infecciones en pacientes cuando se aplican como implantes, sugiriendo
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como solución sintetizar y purificar con solventes como el etanol. Desde hace más
de tres décadas se ha reportado que a pesar de rigurosas medidas de esterilización
de los hidrogeles, los agentes infecciosos pueden permanecer insertados en la matriz
polimérica (Pavlyk, 1998).
Figura 4
Hidrogeles durante el proceso de purificación en agua destilada, sintetizados a partir
de: (a) poliacrilamida. (b) poli (AAm)/ PHBV. . (c) poli (AAm)/ PHB
(a) (b) (c)
Conclusiones
En este trabajo se lograron sintetizar hidrogeles a partir de poliacrilamida e
interpenetrados con los biopoliésteres PHB y PHBV, y se evaluó de manera efectiva su
capacidad de absorción.
También se lograron aislar e identificar cepas bacterianas con potencial para la
degradación de estos hidrogeles
Estos resultados son importantes, ya que constituyen un aporte al campo de nuevos
materiales para liberación controlada o apositos y capaces de biodegradarse.
No obstante, se continuará optimizando la metodología reportada en este trabajo,
ya que en los cultivos controles (sin inoculo bacteriano proveniente del afluente),
también se desarrollaron microorganismos, de lo cual se infiere que a pesar de que
todo fue cuidadosamente esterilizado, hay que mejorar aspectos como el sellado de los
sistemas inoculados. Se avanzará también en el proceso de síntesis y purificación de los
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Volumen XII
hidrogeles, para garantizar la ausencia de microorganismos derivados de los solventes y
líquidos utilizados, que pueden haber permanecido ocluidos a pesar de la esterilización
a que fueron sometidos.
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