CMV-IGM-ELA TEST PKS MEDAC - 0123 CASTELLANO

 
CMV-IgM-ELA Test PKS medac

         Castellano

             0123

       110-PKS-VPS/010512
FABRICANTE

medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
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D-20354 Hamburg

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medac
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                110-PKS-VPS/010512
CMV-IgM-ELA Test PKS medac

Enzimoinmunoensayo con Sistema de Control de Pipeteo para la detección
          de anticuerpos IgM frente al citomegalovirus (CMV)

Cat. no.: 110-PKS

PARA USO EXCLUSIVO EN EL DIAGNOSTICO IN VITRO

INTRODUCCION

El citomegalovirus patógeno humano (CMV) pertenece a la familia
Herpesviridae que se caracterizan por tener un ADN genómico de cadena
doble. Una característica de estos virus es que permanecen de forma
latente en el organismo tras una infección primaria, pudiendo
reactivarse ante diversas circunstancias.

Las infecciones por citomegalovirus que tienen lugar en individuos
inmunocompetentes, normalmente cursan de forma asintomática, pero en
individuos inmunodeprimidos (por ejemplo: pacientes transplantados,
pacientes infectados por VIH, pacientes con tumores y neonatos) las
infecciones producen una variedad de síntomas graves.

El CMV es uno de los patógenos más frecuentes en las infecciones
prenatales que pueden causar una serie de alteraciones graves,
incluyendo daños posteriores al nacimiento en niños asintomáticos.

El test de CMV-IgM-ELA Test PKS medac puede aplicarse para la
detección de anticuerpos IgM específicos del CMV en muestras de suero.
Una infección aguda producida por CMV puede diagnosticarse mediante la
detección de los anticuerpos IgM, aunque debe considerarse que no
siempre se producen estos anticuerpos. En pacientes inmunodeprimidos,
por ejemplo, los anticuerpos IgM frente al CMV raramente pueden
detectarse durante las reactivaciones y las reinfecciones.

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PRINCIPIO DEL ENSAYO

                              La   placa    está   recubierta        con
                              inmunoglobulina anti-IgM humana.

                              Los anticuerpos IgM presentes en la
                              muestra se unen selectivamente a los
                              pocillos.

                             Los anticuerpos IgM específicos
                             para el CMV, capturan el antígeno
                             CMV marcado con peroxidasa (AG =
                             antigeno; P = peroxidasa.

                             Incubación con el         substrato TMB
                             (*). La reacción se        para mediante
                             la adición de ácido        sulfúrico. La
                             absorbancia   se          lee     fotomé-
                             tricamente.

Ventajas del test

 No se obtienen resultados erróneos por reacciones inespecificas ni
  falsos positivos debido a la presencia del factor reumatoide.

 No se produce el bloqueo de la union de los anticuerpos por la
  presencia de títulos elevados de IgG.

 El Sistema del Control de Pipeteo permite monitorizar visualmente
  cada uno de los pasos de la técnica a través de cambios de color.

 Las tiras contienen     pocillos      separables,   permitiendo   un     uso
  eficiente del test.

 Apropriado para la automización en aparatos de ELISA abiertos.

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COMPONENTES DEL KIT
Cat. no.: 110-PKS

1.    MTP
     Microplaca: 12 x 8 pocillos (marcada con CMM, con el soporte y el
     desecante, sellada al vacío en una bolsa de aluminio), divisibles,
     forma U, recubiertos con inmunoglobulina anti-IgM humana, BSA e
     indicador de pH, lista para usar.

2.    CONTROL -
     Control negativo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listos para
     usar,   conteniendo BSA,  fenol,  ProClinTM 300   y  sulfato  de
     gentamicina.

3.    CONTROL +
     Control positivo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listos para
     usar,   conteniendo BSA,  fenol,  ProClinTM 300   y  sulfato  de
     gentamicina.

4.    WB
     Solución de lavado: una botella con 100 ml, PBS/Tween (10x), pH
     7,2 - 7,4, conteniendo ProClinTM 300.

5.    VIR-DIL
     Diluyente de la muestra: una botella con 110 ml, PBS/Tween/BSA, pH
     7,2 - 7,4, listo para usar, conteniendo ProClinTM 300.

6.    ANTIGEN
     CMV-IgM-ELA (antígeno marcado con.énzima): 2 viales, cada uno con
     5,0 ml, liofilizados, conteniendo FCS, teñido de rojo y conjugado-
     HRP.

7.   TMB
     Substrato-TMB: 1 vial con 10 ml, listo para usar.

8.    STOP
     Solución de parada: 2 viales cada uno con 11 ml de 0,5 M ácido
     sulfúrico (H2SO4), lista para usar.

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1.   ALMACENAJE Y ESTABILIDAD

Material/Reactivo   Estado            Almacenamiento           Estabilidad
Kit                 sin abrir         2...8 °C                 Hasta la fecha de
                                                               caducidad
Microplaca          abierto           2...8    °C en la        6 semanas
                                      bolsa    con desecante
Controles           abierto           2...8    °C              6 semanas
Solución de         diluido           2...8    °C              6 semanas
lavado
Diluyente de la     abierto           2...8 °C                 6 semanas
muestra
CMV-IgM-ELA         reconstituido     2...8    °C              5 días
                                      ≤ -18    °C *            6 semanas
Substrato TMB       abierto           2...8    °C              6 semanas
Solución de         abierto           2...8    °C              hasta fecha de
parada                                                         caducidad
*Alicuotar y no someter a más de un ciclo de congelación/descongelación.

No usar los reactivos después de la fecha de caducidad.

2.   REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN

2.1. Agua bidestilada. La utilización de              agua   desionizada   puede
     alterar el procedimiento de la técnica.

2.2. Micropipetas ajustables.

2.3. Contenedores de cristal o plástico limpios para la dilución de la
     solución de lavado y de las muestras.

2.4. Aparatos apropiados para el lavado de la microplaca (p.ej. pipeta
     multicanal o lavador de ELISA).

2.5. Incubador a 37 °C.

2.6. Lector de microplaca con filtros para 450 nm y 620 – 650 nm.

3.   PREPARACION DE LOS REACTIVOS

Antes de comenzar con el procedimiento             de la técnica, todos los
componentes del kit deben alcanzar la              temperatura ambiente para
prevenir la condensación.
Calcular el número de pocillos que se necesitan.

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3.1. Microplaca
     La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el
     desecante cada vez que se retiren los pocillos requeridos para la
     realización de la técnica. El almacenamiento y la estabilidad de
     los pocillos se indican en punto 1.
     Nota: los pocillos de la microplaca tienen un color verde
     luminoso. En algunas ocasiones puede verse una tinción marrón
     verdoso en el interior de los pocillos que se debe al proceso de
     producción y que no tiene ninguna influencia en la realización
     del test.

3.2. Solución de lavado
     Mezclar un volumen de solución de lavado (10 x) con 9 volúmenes
     de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de solución de lavado (10 x)
     con 450 ml de agua bidestilada). Para 8 pocillos, se necesitan 10
     ml de Solución de lavado diluida.

     Si se observan cristales en la solución de lavado (10 x), deberán
     disolverse   por calentamiento (max. a 37 °C), y/o agitación a
     temperatura ambiente.

3.3. CMV-IgM-ELA
     Reconstituir cada vial del CMV-IgM-ELA liofilizado con 5,0 ml del
     diluyente de la muestra. Mezclar suavemente, y vigilar que se
     disuelvan también las partículas que quedan adheridas al tapón
     del vial.
     Después de la reconstitución, el CMV-IgG-ELA tiene color rojo y
     está listo para usar.

No mezclar los reactivos específicos del ensayo procedentes de
diferentes lotes del kit (microplaca, controles, CMV-IgM-ELA). En
contraste con esto, el diluyente de la muestra, el tampón de lavado,
el substrato-TMB y la solución de parada, son en general reactivos que
pueden intercambiarse en todos los kits para detección de virus por
ELISA de medac.

En general, no se recomienda la utilización de reactivos procedentes
de otros fabricantes.

Solamente se obtienen resultados válidos y reproducibles si se realiza
el ensayo ajustándose fielmente al protocolo.

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4.   MUESTRAS
4.1. El ensayo es apropiado para muestras de suero. Las muestras de
     los pacientes se pueden almacenar 7 días entre 2 y 8ºC. Para un
     almacenamiento más prolongado conservar a     ≤ -20 °C. Se debe
     evitar la descongelación y congelación repetida.
4.2. No se necesita pretratamiento del suero, p. ej. inactivación. No
     obstante no deben estar contaminadas con microorganismos ni
     contener células rojas.
4.3. Los sueros tienen que diluirse a 1:100            con el diluyente        de
     muestra,   pudiéndose   hacer diluciones           seriadas  para         la
     determinación del título.

5 A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA

5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre en
     cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca
     requeridos para la realización del test (ver 3.1).

     Los pocillos de la     microplaca      están   listos   para   usar   y   no
     necesitan prelavado.
5.2. Dejar vacío el pocillo A1 como blanco (ver 6.A.). Añadir 50 μl de
     cada muestra diluída a cada pocillo, así como el control positivo
     y el control negativo a sus pocillos respectivos, por duplicado.
     Después de pipetear las muestras (líquidos de pH neutro o básico)
     los pocillos viran a color azul. Una pérdida en el cambio de
     color en alguno de los pocillos, indica que no se ha añadido la
     muestra o el control.
     Si es necesario, se pueden mantener los pocillos de la microplaca
     a temperatura ambiente en una cámara húmeda sin exceder 30 min.,
     o entre 2 - 8 °C sin exceder 60 min, antes del inicio de la
     técnica.

5.3. Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 5 min.) a
     37 °C (± 1 °C) en una cámara húmeda o alternativamente, cubrir la
     placa con una hoja adhesiva.
5.4. Reconstituir el CMV-IgM-ELA (ver 3.3.).
5.5. Transcurido el tiempo de incubación, lavar 3 veces cada uno de
     los pocillos de la microplaca con 200 μl de la solución de
     lavado. Verificar que todos los pocillos están rellenos. Después
     del ciclo de lavado, sacudir la microplaca en papel secante.
     ¡No dejar que se sequen los pocillos! ¡Proceder inmediatamente!

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5.6. Añadir CMV-IgM-ELA (teñido de rojo) a cada pocillo (excepto A1).
    Si   la  técnica   se   realiza        manualmente,         deben   pipetearse
    50 μl de ELA en cada pocillo.
    Tener en cuenta:
    Cuando se trabaja con aparatos automáticos, deben pipetearse
    60 μl de ELA a cada pocillo debido a la alta evaporación en las
    cámaras de incubación de los aparatos.
    Durante la evaluación del test se confirmó la posibilidad de su
    automatización.  Sin   embargo,  se   recomienda  verificar  la
    compatibilidad del test con los aparatos utilizados en el
    laboratorio.

5.7. Incubar nuevamente durante 60 min ( 5 min) a 37 °C ( 1 °C) en
     una cámara húmeda o alternativamente, cubrir la placa con una
     hoja adhesiva.

5.8. Tras la incubación, lavar de nuevo los pocillos de la microplaca
     (ver 5.5.)

5.9. Añadir 50 μl del substrato-TMB a cada pocillo (incluyendo el
     pocillo A1) e incubar durante 30 min. (± 2 min) a 37 °C (± 1 °C)
     en cámara húmeda en oscuridad, o alternativamente, sellar la
     microplaca con una hoja adhesiva. Las muestras positivas viran a
     azul.

5.10. La reacción se para añadiendo 100 μl de la solución de parada a
      cada pocillo (también al pocillo A1). Las muestras positivas
      viran a amarillo.
Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura
fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los
pocillos.
La lectura debe de realizarse en         los     15   minutos    siguientes   a   la
adición de la solución de parada.

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5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA

                      Blanco          Control              Control          Muestra
                       (A1)          negativo             positivo
Control negativo         -             50 μl                  -                   -
Control positivo         -               -                  50 μl                 -
Muestra                  -               -                    -                 50 μl

    Incubar durante 60 min a 37 °C, lavar 3 x con 200 μl solución de
                                 lavado

CMV-IgM-ELA              -          50/60 μl*)           50/60 μl*)       50/60 μl*)

    Incubar durante 60 min a 37 °C, lavar 3 x con 200 μl solución de
                                 lavado

Substrato-TMB          50 μl          50 μl                 50 μl               50 μl
                                                     o
                Incubar durante 30 min a 37              C en oscuridad

Solución de           100 μl          100 μl               100 μl           100 μl
parada
           Leer fotométricamente a 450 nm (ref. 620 - 650 nm)
*)Para técnicas manual/automática (ver 5.6.)

6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION)

     Leer los valores DO a 450 nm (longitud de onda de referencia 620                    -
      650 nm).

     Restar el valor del blanco (pocillo A1) a todos los demás valores
      de DO.

     La media de los valores de la DO del control negativo tiene que
      ser < 0,100.
      La media de los valores de la DO del control positivo tiene que
      ser > 0,800.

     Cut-off = la media de los valores de la DO del control negativo
      + 0,140

     Zona gris = cut-off  10 %

      Repetir el ensayo        si    los    resultados         no     cumplen     con   las
      especificaciones.

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6.B. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

     Muestras con valores de la DO por debajo del límite inferior de la
      zona dudosa, se informan como NEGATIVOS

     Muestras con valores de la DO dentro de la zona dudosa, se
      informan   como   DUDOSAS.  Estas   muestras   deberían  ensayarse
      nuevamente junto con una muestra reciente tomada 14 días más tarde
      con objeto de determinar un cambio en el título.

     Muestras con valores de la DO que superan el límite superior de la
      zona dudosa se informan como POSITIVAS.

     Los resultados deberían siempre interpretarse en relación con los
      datos clínicos y otros parámetros del diagnóstico.

     En muestras únicas no pueden excluirse reacciones                        cruzadas,
      originadas por anticuerpos frente a otros Herpesvirus.

     En muestras negativas las concentraciones elevadas de lípidos
      pueden ocasionar un resultado falso positivo.
      Concentraciones elevadas de hemoglobina o bilirubina, no influyen
      en los resultados de la técnica.

7.     CARACTERISTICAS DEL ENSAYO
Nosotros determinamos las siguientes                   características   del      ensayo
durante la evaluación en el diagnóstico.

7.A. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
482 muestras de suero pertenecientes a donantes de sangre y a
pacientes, fueron estudiadas usando el kit de CMV-IgM-ELA Test PKS
medac y los resultados se compararon con otro kit de ELISA altamente
específico que se utiliza en la rutina de los laboratorios. Los
resultados obtenidos, se detallan en la siguiente tabla:

                                                       Ensayo de referencia
                                                        negativo    positivo
                                   negativo               314            1
     CMV-IgM-ELA Test PKS medac
                                   positivo                1             166

       Sensibilidad    = 99,40 %
       Especificidad   = 99,68 %
       Valor predictivo positivo: 99,40 %
       Valor predictivo negativo: 99,68 %

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7.B.     PRECISION
Muestra       Variación intra-ensayo        Muestra Variación    inter-ensayo
                                                            (n   = 11)
            media DO    DS   CV (%)    n            media DO      DS   CV (%)
    CN        0,034    0,005   15      24      CN     0,050      0,010   20
    CB        0,314    0,013    4      24      CB     0,230      0,021    9
    CP        2,269    0,048    2      24      CP     1,456      0,064    4
   Nº1        0,049    0,008   16      27     Nº4     0,058      0,007   12
   Nº2        0,317    0,023    7      27     Nº5     0,264      0,037   14
   Nº3        2,673    0,086    3      27     Nº6     0,271      0,039   14
                                              Nº7     1,788      0,073    4
CN = control negativo; CB = control intermedio (no se incluye en el kit);
CP = control positivo

ADVERTENCIAS GENERALES EN LA MANIPULACION
 Para evitar contaminaciones cruzadas, no intercambiar los viales ni
  sus tapas respectivas.
 Los reactivos deberán cerrarse correctamente, inmediatamente después
  de utilizarse para evitar la evaporación y la contaminación
  microbiana.
 Después de usarse, los reactivos tienen que almacenarse según las
  indicaciones para garantizar su vida media.
 Tras su utilización todos los reactivos del kit deben almacenarse en
  su caja, para evitar mezclar reactivos de diferentes tests o de
  diferentes lotes (ver 3.)

INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE
 Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo
  de cada país.
 Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado
  que son negativos para el HbsAg, para anticuerpos frente a VIH-1/2 y
  frente a VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos
  materiales al igual que aquellos de origen animal (ver contenido del
  kit) sean manipulados como potencialmente infecciosos y usados con
  todas las precauciones necesarias.
CONSIDERACIONES SOBRE LA ELIMINACION DE LOS RESIDUOS
Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en general
como material peligroso. La eliminación de estos residuos está
regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus
normativas. Contactar con las autoridades locales o con las compañías
de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el que se deben
eliminar los residuos peligrosos.
Fecha de revisión: 01.05.2012

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