CMV-IGM-ELA TEST PKS MEDAC - 0123 CASTELLANO
←
→
Transcripción del contenido de la página
Si su navegador no muestra la página correctamente, lea el contenido de la página a continuación
CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Castellano
0123
110-PKS-VPS/010512FABRICANTE
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Fehlandtstraße 3
D-20354 Hamburg
DISTRIBUCION
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Geschäftseinheit Diagnostika
Theaterstraße 6
D-22880 Wedel
Tel.: ++49/ 4103/ 8006-351
Fax: ++49/ 4103/ 8006-359
DIRECCION DE PEDIDOS
Tel.: ++49/ 4103 /8006-111
Fax: ++49/ 4103 /8006-113
110-PKS-VPS/010512CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Enzimoinmunoensayo con Sistema de Control de Pipeteo para la detección
de anticuerpos IgM frente al citomegalovirus (CMV)
Cat. no.: 110-PKS
PARA USO EXCLUSIVO EN EL DIAGNOSTICO IN VITRO
INTRODUCCION
El citomegalovirus patógeno humano (CMV) pertenece a la familia
Herpesviridae que se caracterizan por tener un ADN genómico de cadena
doble. Una característica de estos virus es que permanecen de forma
latente en el organismo tras una infección primaria, pudiendo
reactivarse ante diversas circunstancias.
Las infecciones por citomegalovirus que tienen lugar en individuos
inmunocompetentes, normalmente cursan de forma asintomática, pero en
individuos inmunodeprimidos (por ejemplo: pacientes transplantados,
pacientes infectados por VIH, pacientes con tumores y neonatos) las
infecciones producen una variedad de síntomas graves.
El CMV es uno de los patógenos más frecuentes en las infecciones
prenatales que pueden causar una serie de alteraciones graves,
incluyendo daños posteriores al nacimiento en niños asintomáticos.
El test de CMV-IgM-ELA Test PKS medac puede aplicarse para la
detección de anticuerpos IgM específicos del CMV en muestras de suero.
Una infección aguda producida por CMV puede diagnosticarse mediante la
detección de los anticuerpos IgM, aunque debe considerarse que no
siempre se producen estos anticuerpos. En pacientes inmunodeprimidos,
por ejemplo, los anticuerpos IgM frente al CMV raramente pueden
detectarse durante las reactivaciones y las reinfecciones.
110-PKS-VPS/010512 1PRINCIPIO DEL ENSAYO
La placa está recubierta con
inmunoglobulina anti-IgM humana.
Los anticuerpos IgM presentes en la
muestra se unen selectivamente a los
pocillos.
Los anticuerpos IgM específicos
para el CMV, capturan el antígeno
CMV marcado con peroxidasa (AG =
antigeno; P = peroxidasa.
Incubación con el substrato TMB
(*). La reacción se para mediante
la adición de ácido sulfúrico. La
absorbancia se lee fotomé-
tricamente.
Ventajas del test
No se obtienen resultados erróneos por reacciones inespecificas ni
falsos positivos debido a la presencia del factor reumatoide.
No se produce el bloqueo de la union de los anticuerpos por la
presencia de títulos elevados de IgG.
El Sistema del Control de Pipeteo permite monitorizar visualmente
cada uno de los pasos de la técnica a través de cambios de color.
Las tiras contienen pocillos separables, permitiendo un uso
eficiente del test.
Apropriado para la automización en aparatos de ELISA abiertos.
110-PKS-VPS/010512 2COMPONENTES DEL KIT
Cat. no.: 110-PKS
1. MTP
Microplaca: 12 x 8 pocillos (marcada con CMM, con el soporte y el
desecante, sellada al vacío en una bolsa de aluminio), divisibles,
forma U, recubiertos con inmunoglobulina anti-IgM humana, BSA e
indicador de pH, lista para usar.
2. CONTROL -
Control negativo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listos para
usar, conteniendo BSA, fenol, ProClinTM 300 y sulfato de
gentamicina.
3. CONTROL +
Control positivo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listos para
usar, conteniendo BSA, fenol, ProClinTM 300 y sulfato de
gentamicina.
4. WB
Solución de lavado: una botella con 100 ml, PBS/Tween (10x), pH
7,2 - 7,4, conteniendo ProClinTM 300.
5. VIR-DIL
Diluyente de la muestra: una botella con 110 ml, PBS/Tween/BSA, pH
7,2 - 7,4, listo para usar, conteniendo ProClinTM 300.
6. ANTIGEN
CMV-IgM-ELA (antígeno marcado con.énzima): 2 viales, cada uno con
5,0 ml, liofilizados, conteniendo FCS, teñido de rojo y conjugado-
HRP.
7. TMB
Substrato-TMB: 1 vial con 10 ml, listo para usar.
8. STOP
Solución de parada: 2 viales cada uno con 11 ml de 0,5 M ácido
sulfúrico (H2SO4), lista para usar.
110-PKS-VPS/010512 31. ALMACENAJE Y ESTABILIDAD
Material/Reactivo Estado Almacenamiento Estabilidad
Kit sin abrir 2...8 °C Hasta la fecha de
caducidad
Microplaca abierto 2...8 °C en la 6 semanas
bolsa con desecante
Controles abierto 2...8 °C 6 semanas
Solución de diluido 2...8 °C 6 semanas
lavado
Diluyente de la abierto 2...8 °C 6 semanas
muestra
CMV-IgM-ELA reconstituido 2...8 °C 5 días
≤ -18 °C * 6 semanas
Substrato TMB abierto 2...8 °C 6 semanas
Solución de abierto 2...8 °C hasta fecha de
parada caducidad
*Alicuotar y no someter a más de un ciclo de congelación/descongelación.
No usar los reactivos después de la fecha de caducidad.
2. REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN
2.1. Agua bidestilada. La utilización de agua desionizada puede
alterar el procedimiento de la técnica.
2.2. Micropipetas ajustables.
2.3. Contenedores de cristal o plástico limpios para la dilución de la
solución de lavado y de las muestras.
2.4. Aparatos apropiados para el lavado de la microplaca (p.ej. pipeta
multicanal o lavador de ELISA).
2.5. Incubador a 37 °C.
2.6. Lector de microplaca con filtros para 450 nm y 620 – 650 nm.
3. PREPARACION DE LOS REACTIVOS
Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, todos los
componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente para
prevenir la condensación.
Calcular el número de pocillos que se necesitan.
110-PKS-VPS/010512 43.1. Microplaca
La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el
desecante cada vez que se retiren los pocillos requeridos para la
realización de la técnica. El almacenamiento y la estabilidad de
los pocillos se indican en punto 1.
Nota: los pocillos de la microplaca tienen un color verde
luminoso. En algunas ocasiones puede verse una tinción marrón
verdoso en el interior de los pocillos que se debe al proceso de
producción y que no tiene ninguna influencia en la realización
del test.
3.2. Solución de lavado
Mezclar un volumen de solución de lavado (10 x) con 9 volúmenes
de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de solución de lavado (10 x)
con 450 ml de agua bidestilada). Para 8 pocillos, se necesitan 10
ml de Solución de lavado diluida.
Si se observan cristales en la solución de lavado (10 x), deberán
disolverse por calentamiento (max. a 37 °C), y/o agitación a
temperatura ambiente.
3.3. CMV-IgM-ELA
Reconstituir cada vial del CMV-IgM-ELA liofilizado con 5,0 ml del
diluyente de la muestra. Mezclar suavemente, y vigilar que se
disuelvan también las partículas que quedan adheridas al tapón
del vial.
Después de la reconstitución, el CMV-IgG-ELA tiene color rojo y
está listo para usar.
No mezclar los reactivos específicos del ensayo procedentes de
diferentes lotes del kit (microplaca, controles, CMV-IgM-ELA). En
contraste con esto, el diluyente de la muestra, el tampón de lavado,
el substrato-TMB y la solución de parada, son en general reactivos que
pueden intercambiarse en todos los kits para detección de virus por
ELISA de medac.
En general, no se recomienda la utilización de reactivos procedentes
de otros fabricantes.
Solamente se obtienen resultados válidos y reproducibles si se realiza
el ensayo ajustándose fielmente al protocolo.
110-PKS-VPS/010512 54. MUESTRAS
4.1. El ensayo es apropiado para muestras de suero. Las muestras de
los pacientes se pueden almacenar 7 días entre 2 y 8ºC. Para un
almacenamiento más prolongado conservar a ≤ -20 °C. Se debe
evitar la descongelación y congelación repetida.
4.2. No se necesita pretratamiento del suero, p. ej. inactivación. No
obstante no deben estar contaminadas con microorganismos ni
contener células rojas.
4.3. Los sueros tienen que diluirse a 1:100 con el diluyente de
muestra, pudiéndose hacer diluciones seriadas para la
determinación del título.
5 A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA
5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre en
cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca
requeridos para la realización del test (ver 3.1).
Los pocillos de la microplaca están listos para usar y no
necesitan prelavado.
5.2. Dejar vacío el pocillo A1 como blanco (ver 6.A.). Añadir 50 μl de
cada muestra diluída a cada pocillo, así como el control positivo
y el control negativo a sus pocillos respectivos, por duplicado.
Después de pipetear las muestras (líquidos de pH neutro o básico)
los pocillos viran a color azul. Una pérdida en el cambio de
color en alguno de los pocillos, indica que no se ha añadido la
muestra o el control.
Si es necesario, se pueden mantener los pocillos de la microplaca
a temperatura ambiente en una cámara húmeda sin exceder 30 min.,
o entre 2 - 8 °C sin exceder 60 min, antes del inicio de la
técnica.
5.3. Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 5 min.) a
37 °C (± 1 °C) en una cámara húmeda o alternativamente, cubrir la
placa con una hoja adhesiva.
5.4. Reconstituir el CMV-IgM-ELA (ver 3.3.).
5.5. Transcurido el tiempo de incubación, lavar 3 veces cada uno de
los pocillos de la microplaca con 200 μl de la solución de
lavado. Verificar que todos los pocillos están rellenos. Después
del ciclo de lavado, sacudir la microplaca en papel secante.
¡No dejar que se sequen los pocillos! ¡Proceder inmediatamente!
110-PKS-VPS/010512 65.6. Añadir CMV-IgM-ELA (teñido de rojo) a cada pocillo (excepto A1).
Si la técnica se realiza manualmente, deben pipetearse
50 μl de ELA en cada pocillo.
Tener en cuenta:
Cuando se trabaja con aparatos automáticos, deben pipetearse
60 μl de ELA a cada pocillo debido a la alta evaporación en las
cámaras de incubación de los aparatos.
Durante la evaluación del test se confirmó la posibilidad de su
automatización. Sin embargo, se recomienda verificar la
compatibilidad del test con los aparatos utilizados en el
laboratorio.
5.7. Incubar nuevamente durante 60 min ( 5 min) a 37 °C ( 1 °C) en
una cámara húmeda o alternativamente, cubrir la placa con una
hoja adhesiva.
5.8. Tras la incubación, lavar de nuevo los pocillos de la microplaca
(ver 5.5.)
5.9. Añadir 50 μl del substrato-TMB a cada pocillo (incluyendo el
pocillo A1) e incubar durante 30 min. (± 2 min) a 37 °C (± 1 °C)
en cámara húmeda en oscuridad, o alternativamente, sellar la
microplaca con una hoja adhesiva. Las muestras positivas viran a
azul.
5.10. La reacción se para añadiendo 100 μl de la solución de parada a
cada pocillo (también al pocillo A1). Las muestras positivas
viran a amarillo.
Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura
fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los
pocillos.
La lectura debe de realizarse en los 15 minutos siguientes a la
adición de la solución de parada.
110-PKS-VPS/010512 75.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA
Blanco Control Control Muestra
(A1) negativo positivo
Control negativo - 50 μl - -
Control positivo - - 50 μl -
Muestra - - - 50 μl
Incubar durante 60 min a 37 °C, lavar 3 x con 200 μl solución de
lavado
CMV-IgM-ELA - 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*)
Incubar durante 60 min a 37 °C, lavar 3 x con 200 μl solución de
lavado
Substrato-TMB 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl
o
Incubar durante 30 min a 37 C en oscuridad
Solución de 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl
parada
Leer fotométricamente a 450 nm (ref. 620 - 650 nm)
*)Para técnicas manual/automática (ver 5.6.)
6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION)
Leer los valores DO a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 -
650 nm).
Restar el valor del blanco (pocillo A1) a todos los demás valores
de DO.
La media de los valores de la DO del control negativo tiene que
ser < 0,100.
La media de los valores de la DO del control positivo tiene que
ser > 0,800.
Cut-off = la media de los valores de la DO del control negativo
+ 0,140
Zona gris = cut-off 10 %
Repetir el ensayo si los resultados no cumplen con las
especificaciones.
110-PKS-VPS/010512 86.B. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Muestras con valores de la DO por debajo del límite inferior de la
zona dudosa, se informan como NEGATIVOS
Muestras con valores de la DO dentro de la zona dudosa, se
informan como DUDOSAS. Estas muestras deberían ensayarse
nuevamente junto con una muestra reciente tomada 14 días más tarde
con objeto de determinar un cambio en el título.
Muestras con valores de la DO que superan el límite superior de la
zona dudosa se informan como POSITIVAS.
Los resultados deberían siempre interpretarse en relación con los
datos clínicos y otros parámetros del diagnóstico.
En muestras únicas no pueden excluirse reacciones cruzadas,
originadas por anticuerpos frente a otros Herpesvirus.
En muestras negativas las concentraciones elevadas de lípidos
pueden ocasionar un resultado falso positivo.
Concentraciones elevadas de hemoglobina o bilirubina, no influyen
en los resultados de la técnica.
7. CARACTERISTICAS DEL ENSAYO
Nosotros determinamos las siguientes características del ensayo
durante la evaluación en el diagnóstico.
7.A. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
482 muestras de suero pertenecientes a donantes de sangre y a
pacientes, fueron estudiadas usando el kit de CMV-IgM-ELA Test PKS
medac y los resultados se compararon con otro kit de ELISA altamente
específico que se utiliza en la rutina de los laboratorios. Los
resultados obtenidos, se detallan en la siguiente tabla:
Ensayo de referencia
negativo positivo
negativo 314 1
CMV-IgM-ELA Test PKS medac
positivo 1 166
Sensibilidad = 99,40 %
Especificidad = 99,68 %
Valor predictivo positivo: 99,40 %
Valor predictivo negativo: 99,68 %
110-PKS-VPS/010512 97.B. PRECISION
Muestra Variación intra-ensayo Muestra Variación inter-ensayo
(n = 11)
media DO DS CV (%) n media DO DS CV (%)
CN 0,034 0,005 15 24 CN 0,050 0,010 20
CB 0,314 0,013 4 24 CB 0,230 0,021 9
CP 2,269 0,048 2 24 CP 1,456 0,064 4
Nº1 0,049 0,008 16 27 Nº4 0,058 0,007 12
Nº2 0,317 0,023 7 27 Nº5 0,264 0,037 14
Nº3 2,673 0,086 3 27 Nº6 0,271 0,039 14
Nº7 1,788 0,073 4
CN = control negativo; CB = control intermedio (no se incluye en el kit);
CP = control positivo
ADVERTENCIAS GENERALES EN LA MANIPULACION
Para evitar contaminaciones cruzadas, no intercambiar los viales ni
sus tapas respectivas.
Los reactivos deberán cerrarse correctamente, inmediatamente después
de utilizarse para evitar la evaporación y la contaminación
microbiana.
Después de usarse, los reactivos tienen que almacenarse según las
indicaciones para garantizar su vida media.
Tras su utilización todos los reactivos del kit deben almacenarse en
su caja, para evitar mezclar reactivos de diferentes tests o de
diferentes lotes (ver 3.)
INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE
Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo
de cada país.
Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado
que son negativos para el HbsAg, para anticuerpos frente a VIH-1/2 y
frente a VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos
materiales al igual que aquellos de origen animal (ver contenido del
kit) sean manipulados como potencialmente infecciosos y usados con
todas las precauciones necesarias.
CONSIDERACIONES SOBRE LA ELIMINACION DE LOS RESIDUOS
Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en general
como material peligroso. La eliminación de estos residuos está
regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus
normativas. Contactar con las autoridades locales o con las compañías
de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el que se deben
eliminar los residuos peligrosos.
Fecha de revisión: 01.05.2012
110-PKS-VPS/010512 10BIBLIOGRAFIA
Enders, G.: Infektionen und Impfungen in der Schwangerschaft. Urban
und Schwarzenberg, München, 9-30 (1990).
Flik, J.: A comparison of 2 quantitative ELISAs used to detect IgG
antibodies against HCMV in transplant recipients. Poster presented at
the 5th Int. Cytomegalovirus Conference (1995).
Jethon, C., Doerr, H. W., Weber, B.: Serologische Diagnose der
Cytomegalievirus-Infektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum
Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern in Serumproben von
immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9),
480-484 (1996).
Reimer, K. und Meisel, H.: Humanes Zytomegalievirus, in: Diagnostische
Bibliothek Bd.1, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschaftsverlag,
279-290 (1996).
Schmitz, H., Doerr, H. W., Kampa, D. and Vogt, A.: Solid-phase enzyme
immunoassay for IgM antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol.
5, 629-634 (1977).
Schmitz, H., Kampa, D., Doerr, H. W., Luthardt, T., Hillemanns, H. G.
and Würtele, A.: IgM antibodies to Cytomegalovirus during pregnancy.
Arch. Virol. 53, 17 7-184 (1977).
Schmitz, H., von Deimling, U. and Flehmig, B.: Detection of IgM
antibodies to Cytomegalovirus (CMV) using an Enzyme-Labelled Antigen
(ELA). J. Gen. Virol. 50, 59-68 (1980).
Steinmann, J. and Bischoff, J.: Comparison of serological methods for
the detection of Cytomegalovirus infection. Lab. Med. 15, 585-589
(1991).
Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder,
U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate
between primary and recurrent or long-term human Cytomegalovirus
infections in pregnant women. Poster presented at the 6th
International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997).
Weber, B., Prosser, F., Munkwitz, A. and Doerr, H. W.: Serological
diagnosis of Cytomegalovirus infection: comparison of 8 enzyme
immunoassays for the detection of HCMV-specific IgM antibody. Clin.
Diagn. Virol. 2, 245-259 (1994).
110-PKS-VPS/010512 11También puede leer
