CMV-IGM-ELA TEST PKS MEDAC CASTELLANO/PORTUGUÊS 0123 - 110-PKS-VPSP/210703
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CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Castellano/Português
0123
110-PKS-VPSP/210703FABRICANTE/FABRICANTE
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Fehlandtstraße 3
D-20354 Hamburg
DISTRIBUCION/DISTRIBUIDOR
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Geschäftseinheit Diagnostika
Theaterstraße 6
D-22880 Wedel
Tel: ++49/ 4103 / 8006 - 0
Fax: ++49/ 4103 / 8006 - 359
DIRECCION DE PEDIDOS/ENDERECO PARA
ENCOMENDAS
Tel.: ++49/ 4103 / 8006 - 111
Fax: ++49/ 4103 / 8006 - 113
Castellano................................ Página 1 – 11
Português................................. Página 12 – 21
Bibliografia/Referencias/Referências...... Página 22
110-PKS-VPSP/210703CMV-IgM-ELA test PKS medac
Enzimoinmunoensayo con Sistema de Control de Pipeteo (PKS) para la
detección de anticuerpos IgM frente al citomegalovirus (CMV)
Cat. no.: 110/PKS
PARA USO EXCLUSIVO EN EL DIAGNOSTICO IN VITRO.
INTRODUCCION
El citomegalovirus (CMV) pertenece a la familia de los herpesvirus
humanos patógenos que se caracterizan por tener un ADN genómico de
cadena doble. Una característica de estos virus es que permanecen de
forma latente en el organismo tras una infección primaria, pudiendo
reactivarse ante diversas circunstancias.
Las infecciones por citomegalovirus que tienen lugar en individuos
inmunocompetentes, normalmente cursan de forma asintomática, pero en
individuos inmunodeprimidos (por ejemplo: pacientes transplantados,
pacientes infectados por VIH, pacientes con tumores y neonatos) las
infecciones producen una variedad de síntomas graves.
El CMV es uno de los patógenos más frecuentes en las infecciones
prenatales que pueden causar una serie de alteraciones graves,
incluyendo daños posteriores al nacimiento en niños asintomáticos.
El test de Medac CMV-IgM-ELA PKS puede aplicarse para la detección de
anticuerpos IgM específicos del CMV en muestras de suero. Una
infección aguda producida por CMV puede diagnosticarse mediante la
detección de los anticuerpos IgM, aunque debe considerarse que no
siempre se producen estos anticuerpos. En pacientes inmunodeprimidos,
por ejemplo, los anticuerpos IgM frente al CMV raramente pueden
detectarse durante las reactivaciones y las reinfecciones.
110-PKS-VPSP/210703 1Además del CMV-IgM-ELA test PKS medac
Cat. nº.: 110/PKS para 96 determinaciones
también distribuímos los siguientes productos:
CMV-IgG-ELA test PKS medac
Cat. nº.: 115/Q/PKS para 96 determinaciones
CMV-IgG-ELA test PKS medac
Cat. nº.: 115/PKS para 96 determinaciones,
CMV-IgG-ELA test PKS medac
Cat. nº.: 116/PKS para 5 x 96determinaciones
CMV-IgA-ELA test PKS medac
Cat. nº.: 112/PKS para 96 determinaciones
110-PKS-VPSP/210703 2PRINCIPIO DEL ENSAYO
La placa está recubierta con
inmunoglobulina anti-IgM humana.
Los anticuerpos IgM presentes
en la muestra se unen
selectivamente a los pocillos.
Los anticuerpos IgM específicos
para el CMV, capturan el
antígeno CMV marcado con
peroxidasa (AG = antigeno; p =
peroxidasa
Incubación con el substrato TMB
(*). La reacción se para
mediante la adición de ácido
sulfúrico. La absorbancia se lee
fotométricamente.
Ventajas del test
) No se obtienen resultados erróneos por reacciones inespecificas ni falsos
positivos debido a la presencia del factor reumatoide.
) No se produce el bloqueo de la union de los anticuerpos por la presencia
de títulos elevados de IgG.
) El Sistema del Control de Pipeteo permite monitorizar visualmente cada uno
de los pasos de la técnica a través de cambios de color.
) Las tiras contienen pocillos separables, permitiendo un uso eficiente del
test.
) Apropriado para la automización en aparatos de ELISA abiertos.
110-PKS-VPSP/210703 3COMPONENTES DEL KIT
Cat. no.: 110/PKS
1. Microplaca: 12 x 8 pocillos (con el soporte y el desecante,
sellados al vacío en una bolsa de aluminio), divisibles, forma U,
recubiertos con inmunoglobulina anti IgM humana, BSA e indicador
de pH, listo para usar.
2. Control Negativo : 2 viales, cada uno con 0.75 ml de suero
humano, listos para usar, conteniendo BSA, fenol, ProClinTM 300 y
sulfato de gentamicina.
3. Control Positivo : 2 viales, cada uno con 0.75 ml de suero
humano, listos para usar, conteniendo BSA, fenol, ProClinTM 300 y
sulfato de gentamicina.
4. Solución de Lavado: una botella con 100 ml, PBS/Tween (10x), pH
7.2 - 7.4, conteniendo ProClinTM 300.
5. Diluyente de Muestra: una botella con 110 ml, PBS/Tween/BSA, pH
7.2 - 7.4, listo para usar, conteniendo ProClinTM 300.
6. CMV-IgM-ELA (Antígeno Marcado Enzimáticamente): 2 viales, cada
uno con 5.0 ml, liofilizados, conteniendo FCS, teñido de rojo y
conjugado-HRP.
7. Substrato - TMB: 1 vial con 10 ml, listo para usar.
8. Solución de Parada: 2 viales cada uno con 14 ml de 0.5 M ácido
sulfúrico (H2SO4), listo para usar.
1. ALMACENAJE Y ESTABILIDAD
MATERIAL/REACTIVO ESTADO ALMACENAMIENTO ESTABILIDAD
Kit sin abrir 2…8ºC Hasta la fecha de
caducidad
Microplaca abierto 2…8ºC en la
bolsa con 6 semanas
desecante
Controles abierto 2…8ºC 6 semanas
Solución de Lavado diluido 2…8ºC 6 semanas
Diluyente de la abierto 2…8ºC 6 semanas
Muestra
CMV-IgM-ELA reconstituido 2…8ºC 5 días
≤ -18ºC * 6 semanas
Substrato TMB abierto 2…8ºC 6 semanas
Solución de Parada abierto 2…8ºC hasta fecha de
caducidad
*¡Alicuotar y no someter a más de un ciclo de congelación/descongelación!
No usar los reactivos después de la fecha de caducidad.
110-PKS-VPSP/210703 42. REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN
2.1. Agua bidestilada. La utilización de agua desionizada puede
alterar el procedimiento de la técnica.
2.2. Micropipetas ajustables.
2.3. Contenedores de cristal o plástico limpios para la dilución de la
Solución de Lavado y de las muestras.
2.4. Aparatos apropiados para el lavado de la microplaca (p.ej. pipeta
multicanal o lavador de ELISA).
2.5. Incubador a 37 °C.
2.6. Lector de microplaca con filtros para 450 nm y 620 – 650 nm.
3. PREPARACION DE LOS REACTIVOS
Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, todos los
componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente para
prevenir la condensación.
Calcular el número de pocillos que se necesitan.
3.1. Microplaca
La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el
desecante cada vez que se retiren los pocillos requeridos para la
realización de la técnica. El almacenamiento y la estabilidad de
los pocillos se indican en la tabla 1.
Nota: los pocillos de la microplaca tienen un color verde
luminoso. En algunas ocasiones puede verse una tinción marrón
verdoso en el interior de los pocillos que se debe al proceso de
producción y que no tiene ninguna influencia en la realización
del test.
3.2. Solución de Lavado
Mezclar un volumen de Solución de Lavado (10 x) con 9 volúmenes
de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de Solución de Lavado (10 x)
con 450 ml de agua bidestilada). Para 8 pocillos, se necesitan 10
ml de Solución de Lavado diluida.
Si se observan cristales en la Solución de Lavado (10 x), deberán
disolverse por calentamiento (max. a 37 ºC), y /o agitación a
temperatura ambiente.
110-PKS-VPSP/210703 53.3. CMV-IgM-ELA
Reconstituir cada vial del CMV-IgM-ELA liofilizado con 5.0 ml del
Diluyente de la Muestra. Mezclar suavemente, y vigilar que se
disuelvan también las partículas que quedan adheridas al tapón
del vial.
Después de la reconstitución, el CMV-IgG-ELA tiene color rojo y está
listo para usar.
No mezclar reactivos de diferentes lotes o de distintos fabricantes.
Solamente se obtienen resultados válidos y reproducibles, si se
procede tal y como se ha descrito y si se utilizan los reactivos
específicos para cada kit.
4. MUESTRAS
4.1. El ensayo es apropiado para muestras de suero.
4.2. No se necesita pretratamiento del suero, p. ej. inactivación. No
obstante no deben estar contaminadas con microorganismos ni
contener células rojas.
4.3. Los sueros tienen que diluirse a 1 : 100 con el Diluyente de
Muestra, pudiéndose hacer diluciones seriadas para la
determinación del título.
5 A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA
5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre en
cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca
requeridos para la realización del test (ver 3.1).
Los pocillos de la microplaca están listos para usar y no
necesitan prelavado.
5.2. Dejar vacío el pocillo A1 como blanco (ver 6.A.). Añadir 50 µl de
cada muestra diluída a cada pocillo, así como el Control Positivo
y el Control Negativo a sus pocillos respectivos, por duplicado.
Después de pipetear las muestras ( líquidos de pH neutro o
básico) los pocillos viran a color azul. Una pérdida en el cambio
de color en alguno de los pocillos, indica que no se ha añadido
la muestra o el control.
Si es necesario, se pueden mantener los pocillos de la microplaca
a temperatura ambiente en una cámara húmeda sin exceder 30 min.,
110-PKS-VPSP/210703 6o entre 2 - 8ºC sin exceder 60 min, antes del inicio de la
técnica.
5.3. Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 2 min.) a
37ºC (± 1ºC) en una cámara húmeda o alternativamente, cubrir la
placa con una hoja adhesiva.
5.4. Reconstituir el CMV-IgM-ELA (ver 3.3.).
5.5. Transcurido el tiempo de incubación, lavar 3 veces cada uno de
los pocillos de la microplaca con 200 µl de la Solución de
Lavado. Verificar que todos los pocillos están rellenos. Después
del ciclo de lavado, sacudir la microplaca en papel secante.
¡No dejar que se sequen los pocillos! ¡Proceder inmediatamente!
5.6. Añadir CMV-IgM-ELA (teñido de rojo) a cada pocillo (excepto A1).
Si la técnica se realiza manualmente, deben pipetearse
50 µl de ELA en cada pocillo.
Tener en cuenta:
Cuando se trabaja con aparatos automáticos, deben pipetearse 60
µl de ELA a cada pocillo debido a la alta evaporación en las
cámaras de incubación de los aparatos.
Durante la evaluación del test se confirmó la posibilidad de su
automatización. Sin embargo, se recomienda verificar la
compatibilidad del test con los aparatos utilizados en el
laboratorio.
5.7. Incubar nuevamente durante 60 min (± 2 min) a 37ºC (± 1ºC) en una
cámara húmeda o alternativamente, cubrir la placa con una hoja
adhesiva.
5.8. Tras la incubación, lavar de nuevo los pocillos de la microplaca
(ver 5.5.)
5.9. Añadir 50 µl del Substrato-TMB a cada pocillo (incluyendo el
pocillo A1) e incubar durante 30 min. (± 2 min) a 37ºC ± 1ºC) en
cámara húmeda en oscuridad, o alternativamente, sellar la
microplaca con una hoja adhesiva. Las muestras positivas viran a
azul.
5.10. La reacción se para añadiendo 100 µl de la Solución de Parada a
cada pocillo (también al pocillo A1). Las muestras positivas
viran a amarillo.
110-PKS-VPSP/210703 7Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura
fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los
pocillos.
¡La lectura debe de realizarse en los 15 minutos siguientes a la
adición de la solución de parada!
5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA
Blanco Control Control Muestra
(A1) Negativo Positivo
Control Negativo - 50 µl - -
Control Positivo - - 50 µl -
Muestra - - - 50 µl
Incubar durante 60 min a 37°C, lavar 3x con 200 µl solución de lavado.
CMV-IgM-ELA - 50/60 µl *) 50/60 µl *) 50/60 µl *)
Incubar durante 60 min.a 37°C, lavar 3x con 200 µl de la solución de lavado.
Substrato-TMB 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
Incubar durante 30 min a 37oC en oscuridad.
Solución de Parada 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Leer fotométricamente a 450 nm (ref. 620 - 650 nm)
*)Para técnicas manual/automática (ver 5.6.)
6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION)
∗ Leer los valores DO a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 -
650 nm).
∗ Restar el valor del blanco (pocillo A1) a todos los demás valores
de DO.
∗ La media de los valores de la DO del Control Negativo tiene que
ser < 0.100.
La media de los valores de la DO del Control Positivo tiene que
ser > 0.800.
∗ Cut-off = la media de los valores de la DO del Control Negativo +
0.140.
∗ Zona gris = cut-off ± 10%.
110-PKS-VPSP/210703 86.B. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
∗ Muestras con valores de la DO por debajo del límite inferior de la
zona dudosa, se informan como NEGATIVOS
∗ Muestras con valores de la DO dentro de la zona dudosa, se
informan como DUDOSAS.
Estas muestras deberían ensayarse nuevamente junto con una muestra
reciente tomada 14 días más tarde con objeto de determinar un
cambio en el título.
∗ Muestras con valores de la DO que superan el límite superior de la
zona dudosa se informan como POSITIVAS.
∗ Los resultados deberían siempre interpretarse en relación con los
datos clínicos y otros parámetros del diagnóstico.
∗ En muestras únicas no pueden excluirse reacciones cruzadas,
originadas por anticuerpos frente a otros Herpesvirus.
∗ En muestras negativas las concentraciones elevadas de lípidos
pueden ocasionar un resultado falso positivo.
Concentraciones elevadas de hemoglobina o bilirubina , no influyen
en los resultados de la técnica.
7. CARACTERISTICAS DEL ENSAYO
Nosotros determinamos las siguientes características del ensayo
durante la evaluación en el diagnóstico.
7.A. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
482 muestras de suero pertenecientes a donantes de sangre y a
pacientes, fueron estudiadas usando el kit de Medac PKS-ELA-IgM-
CMV y los resultados se compararon con otro kit de ELISA altamente
específico que se utiliza en la rutina de los laboratorios. Los
resultados obtenidos, se detallan en la siguiente tabla:
110-PKS-VPSP/210703 9Ensayo de referencia
negativo positivo
CMV-IgM-ELA test PKS negativo 314 1
positivo 1 166
Sensibilidad = 99.40%
Especificidad = 99.68%
Valor predictivo positivo: 99.40%
Valor predictivo negativo: 99.68%
7.B. PRECISION
Muestra variación Intra-ensayo Muestra variación Inter-ensayo
(n =11)
media DO S.D. C.V. (%) n media DO D.S. C.V. (%)
CN 0,034 0,005 15 24 CN 0,050 0,010 19
CB 0,314 0,013 4 24 CB 0,230 0,021 9
CP 2,269 0,048 2 24 CP 1,456 0,064 4
Nº1 0,049 0,008 15 27 Nº4 0,058 0,007 13
Nº2 0,317 0,023 7 27 Nº5 0,264 0,037 14
Nº3 2,673 0,086 3 27 Nº6 0,271 0,039 14
Nº7 1,788 0,073 4
CN = Control Negativo ; CB = Control intermedio (no se incluye en el kit);
CP = Control Positivo
ADVERTENCIAS GENERALES EN LA MANIPULACION
* Para evitar contaminaciones cruzadas, no intercambiar los viales ni
sus tapas respectivas.
* Los reactivos deberán cerrarse correctamente, inmediatamente después
de utilizarse para evitar la evaporación y la contaminación
microbiana.
* Después de usarse, los reactivos tienen que almacenarse según las
indicaciones para garantizar su vida media.
* Tras su utilización todos los reactivos del kit deben almacenarse en
su caja, para evitar mezclar reactivos de diferentes tests o de
diferentes lotes (ver 3.)
110-PKS-VPSP/210703 10INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE
* Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo
de cada país.
* Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado
que son negativos para el HbsAg, para anticuerpos frente a VIH-1/2 y
para el VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos
materiales al igual que aquellos de origen animal (ver contenido del
kit) sean manipulados como potencialmente infecciosos y usados con
todas las precauciones necesarias.
CONSIDERACIONES SOBRE LA ELIMINACION DE LOS RESIDUOS
∗ Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en
general como material peligroso. La eliminación de estos residuos
está regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus
normativas. Contactar con las autoridades locales o con las
compañías de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el
que se deben eliminar los residuos peligrosos.
Fecha de revisión: 21.07.2003
110-PKS-VPSP/210703 11CMV-IgM-ELA test PKS medac
Imunoensaio enzimático com Sistema Controlo de Pipetagem (PKS) para a
detecção de anticorpos IgM para Citomegalovírus (CMV)
Cat. No.: 110/PKS
Apenas para utilização em diagnóstico in vitro
INTRODUÇÃO
O Citomagelovírus (CMV) pertence à família dos Herpesviridae que é
caracterizada por um genoma DNA de cadeia dupla. É característica
estes vírus persistirem num estado latente no organismo após infecção
primária. Podem assim ocorrer reinfecções sob determinadas
circunstâncias.
O curso que as infecções CMV tomam em indivíduos imunocompetentes é
normalmente assintomáticos sem qualquer sintoma, Em indivíduos
imunocomprometidos (e.g. Pacientes transplantados, indivíduos HIV
positivos, pacientes tumorais, recém-nascidos) observam-se uma
variedade de sintomas graves.
O CMV é um dos patogénios mais frequentes em infecção pré-natal que
pode causar uma série de desordens graves incluindo lesões tardias em
crianças nascidas sem sintomas.
O kit CMV-IgM ELA pode ser aplicado para a detecção de anticorpos CMV
IgM específicos em soro. Uma infecção CMV aguda pode ser diagnosticada
pela demonstração de anticorpos IgM. Deve-se ter em conta que nem
sempre são produzidos anticorpos IgM. Em pacientes imunodeprimidos
raramente se detectam anticorpos CMV IgM durante reactivações e
reinfecções.
110-PKS-VPSP/210703 12Para além de CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Cat.-No.: 110/PKS para 96 determinações
também temos os seguintes produtos:
CMV-IgG-ELISA PKS medac
Cat. No.: 115/Q/PKS para 96 determinações,
CMV-IgG-ELA Test PKS medac
Cat. No.: 115/PKS para 96 determinações,
CMV-IgG-ELA Test PKS medac
Cat. No.: 116/PKS para 96 determinações ,
CMV-IgA-ELA Test PKS medac
Cat. No.: 112/PKS para 96 determinações.
110-PKS-VPSP/210703 13PRINCÍPIO DO TESTE
A placa é revestida com
imunoglobulina IgM anti-humana.
As IgM da amostra ligam-se
selectivamente aos poços.
Os anticorpos IgM específicos
do CMV ligam-se ao antigénio CMV
marcado com Peroxidase.
Incubação com substrato TMB (*). A
reacção é parada pela adição de
ácido sulfúrico. A absorção é lida
fotometricamente.
Vantagens do teste
) Ausência de reacções inespecíficas e ausência de resultados
falso-positivos causados por factores reumatoides.
) Ausência de bloqueamento de anticorpos IgM por um elevado título
de IgG.
) O PKS permite monitorizar visualmente e fotometricamente cada
passo de pipetagem através das alterações de cor.
) As tiras separáveis permitem uma utilização eficiente.
) Adequado para automatização em aparelhos abertos.
110-PKS-VPSP/210703 14CONTEÚDO DO KIT
Catálogo no. 110/PKS
1. Microplaca: 12 × 8 poços separáveis, com suporte e dissecante
selados em vácuo em saco de alumínio, formato U, revestidos
imunoglobulina IgM anti-humana de cabra, BSA e indicador de pH,
pronta a usar.
2. Controlo Negativo: 2 frascos de 0.75 ml cada, soro humano, azul,
pronto a usar, contém BSA, fenol, ProClin 300 e sulfato de
gentamicina.
3. Controlo Positivo: 2 frascos de 0.75 ml cada, soro humano, azul,
pronto a usar, contém BSA, fenol, ProClin 300 e sulfato de
gentamicina.
4. Tampão de Lavagem: 1 frasco de 100 ml, PBS/Tween (10 ×), pH 7.2 –
7.4, contém ProClin 300.
5. Diluente de Amostras: 1 frasco de 110 ml, PBS/Tween/BSA, pH 7.2 –
7.4, pronto ausar, contém ProClin 300.
6. CMV-IgM-ELA (Antigénio marcado enzimaticamente): 2 frascos com 5.0
ml cada, liofilizados, corados de vermelho, conjugado-HRP, contem
FCS.
7. Substrato TMB: 1 frasco com 10 ml, pronto a usar.
8. Solução Stop: 2 frascos de 14 ml cada, 0.5 M de ácido sulfúrico
(H2SO4), pronto a usar.
1. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Material/Reagente Estado Armazenamento Estabilidade
Kit fechado 2...8°C Prazo de validade
Microplaca aberta 2...8°C no saco 6 semanas
c/ dissecante
Controlos abertos 2...8°C 6 semanas
Tampão de Lavagem diluído 2...8°C 6 semanas
CMV-IgM-ELA reconstituído 2...8°C 5 dias
≤ −18°C∗ 6 semanas
Substrato TMB aberto 2...8°C 6 semanas
Solução Stop aberta 2...8°C Prazo de validade
∗ Aliquotar e não congelar após descongelado!
Não utilizar os reagentes após a data do prazo de validade
110-PKS-VPSP/210703 152. REAGENTES E MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
2.1. Água redestilada. A utilização de água desionizada pode afectar o
procedimento do teste.
2.2. Micropipetas ajustáveis.
2.3 Recipientes de vidro ou plástico para a diluição do Tampão de
Lavagem.
2.4. Dispositivo adequado para a lavagem da microplaca (Multipipeta ou
lavador ELISA).
2.5. Incubadora para 37°C.
2.6. Leitor com filtros para 450 nm, e 620 - 650 nm.
3. PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
Antes de iniciar o teste os reagentes devem ser colocados à
temperatura ambiente.
Calcular o número de poços necessários
3.1. Microplaca
O saco de alumínio tem de ser bem fechado juntamente com o
dissecante após cada remoção de poços.
Nota: Os poços da microplaca têm uma cor verde clara. Possíveis
manchas verde acastanhadas dentro dos poços devem-se ao processo
de produção e não influenciam a performance do teste.
3.2. Tampão de Lavagem
Misturar um volume de Tampão de Lavagem (10 ×) com nove volumes de
água (e.g. 50 ml de Tampão de Lavagem (10 x) com 450 ml de água).
São necessários 10 ml de Tampão de Lavagem diluído para oito
poços.
Os cristais no Tampão de Lavagem (10 x) têm de ser dissolvidos
aquecendo (máx. 37°C) e/ou agitando à temperatura ambiente.
3.3. CMV-IgM-ELA
Reconstituir o CMV-IgM-ELA liofilizado com 5.0 ml de Diluente de
Amostras. Misturar com cuidado. Misturar cuidadosamente e ter
atenção para que as partículas junto à abertura também sejam
dissolvidas.
110-PKS-VPSP/210703 16Após reconstituição o CMV-IgM-ELA tem cor vermelha e está pronto a
usar.
Não misturar reagentes de diferentes lotes ou produtores.
Apenas se obtêm resultados válidos e reprodutíveis quando o
procedimento é rigorosamente seguido e são usados os reagentes
específicos do kit.
4. AMOSTRA
4.1. O teste é adequado para soro.
4.2. Não é necessário pré-tratamento da amostra, e.g. inactivação.
Contudo não devem esta contaminados com microorganismos nem
conter glóbulos vermelhos.
4.3. As amostras têm de ser diluídas 1 : 100 com Diluente de
Amostras. Podem ainda ser diluídas para determinação de título.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Cortar o saco de alumínio e retirar o número de poços
necessários (ver 3.1.)
Os poços da microplaca estão prontos a usar e não têm de ser
pré-lavados.
5.2. Deixar o poço A1 vazio para branco (ver 6 A). Adicionar 50 µl de
amostra diluída, assim como de Controlo Negativo e Controlo
Positivo, em duplicado aos poços.
Após pipetar as amostras (fluidos de pH neutro ou básico) os
poços ficam azuis. Se esta alteração de cor não se verificar
significa que não foi adicionada amostra ou controlo.
Se necessário a placa pode ficar numa câmara húmida até 60
minutos a 2 - 8°C antes de continuar.
5.3. Incubar a microplaca 60 minutos ( ± 2 min) a 37°C (± 1°C) numa
câmara húmida ou selada.
5.4. Reconstituir o CMV-IgM-ELA (ver 3.3)
5.5. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com 200 µl de Tampão
de Lavagem por poço. Todos os poços devem ser preenchidos. Após
a lavagem bater em papel absorvente.
Não deixar secar os poços! Continuar o teste imediatamente!
110-PKS-VPSP/210703 175.6. Adicionar 50 µl de CMV-IgM-ELA (vermelho) a cada poço (excepto
A1).
Se o teste for feito manualmente têm de ser pipetados 50 µl de
conjugado.
Nota:
Se o teste for feito em sistema automático têm de ser pipetados
60 µl de conjugado devido à maior evaporação nas câmaras húmidas
dos instrumentos.
A adequação do teste para aparelhos automáticos foi confirmada
durante a avaliação do teste. Contudo, recomenda-se a
verificação da compatibilidade do teste com o aparaelho
utilizado no laboratório.
5.7. Incubar a microplaca 60 minutos ( ± 2 min) a 37°C (± 1°C) numa
câmara húmida ou selada.
5.8. Após a incubacao, lavar a microplaca novamente (ver 5.5.)
5.9. Adicionar 50 µl de substrato TMB a todos os poços (incluindo A1)
e incubar 30 minutos (± 1 min) a 37°C numa câmara húmida ou
selados e no escuro. As amostras positivas ficam azuis.
5.10 Parar a reacção adicionando 100 µl de Solução Stop a cada poço
(incluindo A1). As amostras positivas ficam amarelas.
Limpar os poços por baixo antes da leitura fotometrica e ter atenção
para que não hajam bolhas de ar nos poços.
A leitura deve ser efectuada até 15 minutos após a adição da Solução
Stop.
5.B. TABELA PARA O PROCEDIMENTO
Branco Controlo Controlo Amostra
(A1) Negativo Positivo
Cont. Negativo - 50 µl - -
Cont. Positivo - - 50 µl -
Amostra - - - 50 µl
Incubar 60 minutos a 37°C, lavar 3 × com 200 µl de Tampão de Lavagem
CMV-IgM-ELA - 50/60 µl* 50/60 µl* 50/60 µl*
Incubar 60 minutos a 37°C, lavar 3 × com 200 µl de Tampão de Lavagem
Substrato TMB 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl
Incubar 30 minutos a 37°C no escuro
Solução Stop 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Leitura a 450 nm (ref. 620-650)
*) procedimento manual /automatico (ver 5.5)
110-PKS-VPSP/210703 186.A. CALCULO DOS RESULTADOS
∗ Ler os valores de DO a 450 nm (ref. 620 – 650 nm).
∗ Subtrair o valor de DO do branco (poço A1) de todos os outros
valores de DO.
∗ O valor médio de DO para o Controlo Negativo tem de ser
< 0.100.
O valor médio de D.O para o Controlo Positivo tem de ser > 0.800.
∗ Cut-off = valor médio da DO do Controlo Negativo + 0.140
∗ Zona cinzenta = Cut-off ± 10%
6.B. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
∗ Amostras com valores de D.O abaixo do limite inferior da zona
cinzenta são consideradas NEGATIVAS.
∗ Amostras com valores de D.O entre a zona cinzenta são
consideradas EQUIVOCAS.
Estas amostras devem ser retestadas juntamente com uma amostra
fresca obtida 14 dias mais tarde para determinar alteração de
título.
∗ Amostras com valores de D.O acima do limite superior da zona
cinzenta são consideradas POSITIVAS.
∗ Os resultados devem sempre ser interpretados em conjunto com
dados clínicos e parâmetros de diagnóstico adicionais.
∗ Reacções falso-positivas baixas causadas por anticorpos contra
outros Herpesvirus ou por anticorpos heterofílicos não podem ser
excluídos em casos isolados
∗ Concentrações muito elevadas de lípidos em amostras podem
influenciar a concentração de anticorpos medida. Altas
concentrações de hemoglobina ou Bilirubina não influenciam os
resultados do teste
110-PKS-VPSP/210703 197. CARACTERÍSTICAS DE PERFORMANCE
Foram determinadas as seguintes características de performance
durante a avaliação diagnostica
7.A. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE
Foram testadas 482 amostras, selecciondas de dadores de sangue e
doentes, com o kit em comparação com um ELISA altamente
específico utilizado em rotina. Os resultados foram:
Teste de referência
Negativo Positivo
CMV-IgM-ELA test PKS Negativo 314 1
Positivo 1 166
Sensibilidade = 99.40%
Especificidade = 99.68%
Valor predictivo positivo: 99.40%
Valor predictivo negativo: 99.68%
7.B. PRECISÃO
Amostra Variação intra-ensaio Amostra Variação inter-ensaio
(n=11)
DO SD VC(%) n DO SD VC(%)
CN 0.034 0.005 15 24 CN 0.050 0.010 19
CPF 0.314 0.013 4 24 CPF 0.230 0.021 9
CP 2.269 0.048 2 24 CP 1.456 0.064 4
Nº1 0.049 0.008 15 27 Nº4 0.058 0.007 13
Nº2 0.317 0.023 7 27 Nº5 0.264 0.037 14
Nº3 2.673 0.086 3 27 Nº6 0.271 0.039 14
Nº7 1.788 0.073 4
CN = Controlo Negativo; CPF = Controlo Positivo Fraco (Nao incluído no
kit);CP = Controlo Positivo;
110-PKS-VPSP/210703 20CONSELHOS GERAIS DE MANIPULAÇÃO
∗ Para evitar contaminação cruzada não trocar os frascos e as suas
tampas.
∗ Os reagentes têm de ser fechados imediatamente após utilização
para evitar evaporação e contaminação microbiana.
∗ Após utilização, os reagentes têm de ser armazenados como
indicado para garantir a validade
∗ Após utilização todos os componentes do kit devem ser
armazenados nos recipientes originais para evitar a mistura com
reagentes de outros testes ou lotes (ver também 3.)
INFORMAÇÃO SOBRE SAÚDE E HIGIENE
∗ Os regulamentos de segurança e saúde locais têm de ser tidos em
conta.
∗ Os reagentes de origem humana foram testados e considerados
negativos para HBsAg, para anticorpos HIV-1/2 e para HCV.
Contudo, recomenda-se que estes materiais, bem como os de origem
animal (ver conteúdo do kit), sejam manipulados como
potencialmente infecciosos e utilizados com todas as precauções
necessárias.
CONSIDERAÇÕES DE ELIMINAÇÃO
Os resíduos de químicos e preparações são geralmente considerados como
desperdício contaminante. A eliminação deste tipo de desperdício é
regulada através de leis e regulamentos nacionais e regionais.
Contactar as autoridades locais ou companhias de gestão de lixos para
saber procedimentos a tomar.
Data da revisão: 21.07.2003
110-PKS-VPSP/210703 21BIBLIOGRAFIA/REFERÊNCIAS
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Cytomegalievirus-Infektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum
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immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9),
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110-PKS-VPSP/210703 22También puede leer
