ESTUDIO QUÍMICO PRELIMINAR Y EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD
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ESTUDIO QUÍMICO PRELIMINAR Y EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LA ESPECIE NATIVA Ardisia sp. (MYRSINACEAE) Erika Andrea Plazas González RESUMEN Por medio del análisis fitoquímico preliminar del extracto etanólico de la parte aérea de la especie Ardisa sp., se evidenció la presencia de metabolitos tipo saponina, flavonoide fenol, quinona, esteroide y triterpeno. El extracto de etanol y los sub-extractos de éter de petróleo, cloroformo y acetato de etilo provenientes del fraccionamiento sólido-líquido, presentaron actividad inhibitoria frente a Staphylococus aureus. Los sub-extractos de cloroformo y acetato de etilo mostraron halos de inhibición mayores al control positivo. El extracto etanólico y el sub-extracto de acetato de etilo inhibieron el crecimiento de Escherichia coli, el halo de inhibición del extracto de acetato de etilo fue mayor al del control positivo. Todos los extractos evaluados presentaron una inhibición significativa del crecimiento frente a Pseudomonas aeruginosa. PALABRAS CLAVES: Ardisia sp., metabolitos secundarios, sub-extractos de polaridad creciente, actividad antibacterial, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. INTRODUCCIÓN Ardisia es el género de plantas más extenso perteneciente a la familia Myrsinaceae. Es nativo de regiones tropicales y subtropicales de América, Asia y Australia. Cuenta con aproximadamente 500 especies de árboles y arbustos hasta de 8 m de altura. Algunas especies de este género son empleadas con fines ornamentales, alimenticios y medicinales. Debido a los escasos estudios químicos las especies del género Ardisia son una fuente potencial de compuestos novedosos y biológicamente activos1. La especie más representativa del género es Ardisia crenata, nativa del sudeste asiático. Esta especie se caracteriza por poseer frutos en forma de bayas de color rojo muy brillante, por lo cual se conoce popularmente como árbol de coral2. Las especies del género Ardisia se distribuyen en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, principalmente en América, Asia y Australia. En Colombia se han encontrado especies de este género en la cordillera oriental y los departamentos de Antioquia, Cundinamarca y Chocó. A algunas especies del departamento de Cundinamarca se les conoce popularmente como “Cucharos”3,4.
Las especies del género Ardisia han sido empleadas como fuente de alimento y
para el tratamiento de diferentes dolencias, aunque este conocimiento es más bien
limitado. Las bayas de algunas especies del Himalaya como Ardisia elliptica y
Ardisia macrocarpa se han usado para consumo humano5.
Ardisia japonica es la especie con mayor numero de usos medicinales, este
arbusto nativo del sudeste de Asia es una especie muy reconocida dentro de la
medicina tradicional China. Ha sido usada para tratar diferentes enfermedades
como conjuntivitis, bronquitis, neumonía, traumatismo, tuberculosis, pancreatitis y
algunos tipos de cáncer5.
Las hojas de la especie Ardisia compresa de amplia distribución en centro y sur
América, se han utilizado en la provincia de Michoacán en México para el
tratamiento de diferentes dolencias relacionadas con el hígado, incluyendo cáncer
de hígado6.
El potencial fitoquímico del género Ardisia ha sido poco explorado. Los estudios
químicos realizados se limitan principalmente a especies orientales como Ardisia
crenata, Ardisia crispa y Ardisia japonica. Estos estudios han permitido aislar una
variedad de metabolitos secundarios, entre ellos: saponinas, isocumarinas,
quinonas, alquilfenoles, entre otros5.
Algunas saponinas del género Ardisia han sido aisladas principalmente de las
raíces de diferentes especies como Ardisia crenata, Ardisia crispa, Ardisia
mamillata y Ardisia pusilla. De la especie Ardisia mamillata fueron aisladas dos
nuevas saponinas ardisimamillosidas A (1) y B (2) (figura 1)7.
H3C COH
H3C COH
O
O OH
CH3 CH3
CH3 CH3
O
OH CH3
CH3 OH
OH O
O O
O O O
O O H OH
H OH OH CH3
OH CH3 H3C
H3C HO
HO OH O
OH O
O
O
O O
O HO O H
HO H
CH3 OH CH3 OH
HO HO
OH OH OH 1
OH OH OH
Figura 1: saponinas de Ardisia mamillata
Algunas saponinas aisladas de especies del género Ardisia han presentado
actividades biológicas significativas. Las ardisiacrispinas A y B de Ardisia crispa
han mostrado actividad de contracción del útero y actividad inmuno-estimulatoria8.
2
La bergenina (3) (figura 2) es una isocumarina que ha sido aislada de diferentes
especies del género, entre ellas, Ardisia colorata, A. crenata, A. elliptica y A.
japonica. Esta isocumarina ha presentado un amplio rango de actividades
biológicas, entre las que se destacan anti-VIH, hepato-protectora, antifúngica5.
O
HO
O
H
OH
H3CO
H
OH O
OH
CH2OH
Figura 2: Isocumarina de Bergenina 3
Las quinonas del género Ardisia se caracterizan por poseer cadenas alquílicas
largas, saturadas o insaturadas y sustituyentes metoxilo o hidroxilo, como el
dímero de ardisina (4) aislada de Ardisia japonica (figura 3) 5.
CH3
OH O
OH
H3C O
O OH
OH O
4
Figura 3: Quinona dimérica de Ardisia japonica
Las quinonas del género Ardisia poseen un amplio espectro de actividades
biológicas, entre las que es posible resaltar la actividad citotóxica frente a
diferentes líneas celulares. Un estudio realizado con quinonas de Ardisia crispa
mostró la potencial actividad anti cancerígena tanto in vitro como in vivo en
meloma humano. Los estudios in vivo demostraron que las quinonas de Ardisia
inhibían el crecimiento de tumores y suprimían la metástasis pulmonar.
Actualmente se está desarrollando un fármaco antimetastático de las quinonas de
Ardisia crsipa5.
Los productos naturales son la fuente más importante para el desarrollo de nuevos
agentes terapéuticos. Alrededor del 25% de los fármacos prescritos en el Mundo
provienen de plantas. De las 252 sustancias consideradas esenciales y básicas
por la Organización Mundial de la Salud (OMS), 11% provienen exclusivamente de
plantas y un número significativo son fármacos sintéticos obtenidos de precursores
naturales8. La química de los productos naturales está orientada a la búsqueda de
compuestos con diversas actividades biológicas entre ellas actividad antibacterial.
Actualmente cerca de 200 nuevos compuestos de origen natural se encuentran en
diferentes fases clínicas para el desarrollo de agentes anti-cancerigenos y anti-
infectivos, siendo los productos naturales de plantas los más representativos
numéricamente9.
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal
El material vegetal de la especie Ardisia sp. se recolectó en Cruz verde, junto con
el biólogo Héctor Lancheros en Septiembre de 2009. Un espécimen reposa en el
Herbario del Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis.
Método de extracción
Para la obtención del extracto etanólico las hojas y tallos de Ardisia sp. se secaron
a temperatura ambiente durante 3 días. El material vegetal se molió hasta obtener
270,5 g de un polvo fino uniforme. A este material se le realizó una extracción por
maceración en frío con etanol al 96% durante 35 días. El extracto etanólico
resultante se filtró y concentró a presión reducida, obteniendo 53,20 gramos de
extracto crudo (figura 4).
Ardisia sp. Secado a T ambiente Moler y 270,5 g de hojas
Parte aérea durante 3 días pesar y tallos secos
molidas
Extracto EAPA (53,20g) Concentrar, Extracción con EtOH 96% por
Extracto verde oscuro secar y pesar maceración en frío (35 días)
Figura 4. Procedimiento de obtención del extracto de parte aérea de Ardisia sp.
Análisis fitoquímico preliminarEl análisis fitoquímico preliminar se llevo a cabo siguiendo la metodología
propuesta por los profesores Antonio Sanabria10, Olga lock11 y María Bilbao12.
Para determinar la posible presencia de distintos tipos de metabolitos secundarios.
En el figura 5 se resumen los tipos de metabolitos analizados.
Extracto etanólico
Alcaloides Esteroides, triterpenos Sesquiterpenlactonas
Flavonoides Cumarinas
Quinonas Cardiotonicos
Saponinas
Taninos
Figura 5. Metodología general para el análisis fitoquímico preliminar
Fraccionamiento
A 52,28 g de extracto etanólico de parte aérea de la especie Ardisia sp., se les
realizó un fraccionamiento sólido-líquido directo. El extracto sólido de color verde
oscuro y olor característico, se homogenizó. Esta mezcla sólida se puso en
contacto con el solvente, en calentamiento (sido mantenidas a 4°C en caldo nutritivo hasta el momento de la realización del
ensayo.
Se empleó el método de difusión en discos para la determinación preliminar de la
actividad antibacteriana. Como medio de cultivo se empleó agar Mueller-Hilton
(Oxoid), el cual se impregnó con suspensiones microbianas de aproximadamente
1.5×106 UFC/mL, correspondientes al tubo 1 en la escala de turbidez de
Macfarland, por medio de una escobilla para facilitar la difusión. Los extractos se
disolvieron en DMSO hasta una concentración final de 30 mg/ml 13.
Se impregnaron discos blancos estériles de 6,0 mm de diámetro con los extractos
de prueba a un volumen de 10 μl/disco. Se uso como control positivo una solución
de cloranfenicol a una concentración de 100 μg/ml (10 μl/disco) y como control
negativo 10 μl de DMSO. Posteriormente las cajas se incubaron a 36 °C, durante
24 horas14. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Las actividades
antibacterianas de los extractos de prueba se determinaron mediante la medición
del diámetro de la zona de inhibición en milímetros y se calculó el % de inhibición
mediante la siguiente fórmula15:
D halo extracto − D halo blanco
% ó = x 100
D halo control positivo − D blanco
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se realizó una extracción exhaustiva del material vegetal en maceración hasta
peso constante del extracto obtenido después de la evaporación del solvente, lo
que indicó la finalización de la extracción. El extracto obtenido se dejo secar en la
cabina de extracción y se peso, para calcular el rendimiento de extracción
respecto al pesó del material vegetal seco y molido, de acuerdo con la siguiente
fórmula:
peso del extracto seco
% = x 100
Peso del material vegetal seco
En la tabla 1 se reporta el rendimiento de extracción para el extracto etanólico de
la parte aérea de Ardisia sp.Tabla 1. Porcentaje de rendimiento de extracción con etanol.
Sigla Parte de la Masa del Masa del Rendimiento
planta material extracto de
vegetal seco (g) extracción
(g) (%)
EAPA Hojas y 270,5 53,20 19,67
tallos
Análisis fitoquímico preliminar
El análisis fitoquímico preliminar se llevo a cabo para determinar la posible
presencia grupos de metabolitos secundarios, empleando diferentes reacciones
de coloración. En la siguiente tabla se resumen las pruebas realizadas para cada
tipo de metabolito y los resultados obtenidos.
Tabla 2: Resultados del análisis fitoquímico preliminar del extracto etanólico de
la parte aérea de Ardisia sp.
METABOLITO PRUEBA RESULTADO
EAPA
Alcaloides Dragendorff -
HCL 5 % Mayer -
Alcaloides Dragendorff -
Solubles en Mayer -
CHCl3
Flavonoides Shinoda +
HCl -
Taninos Gelatina -
Cloruro ferrico +
Saponinas Espuma -
Quinonas Zn/HCl -
Zn/NaOH -
NH3 -
Bornträger- -
Kraus
Cumarinas Fluorescencia -
Hidroxamato -
ferrico
Lactonas Vainillina -
Terpenicas Hidroxamato -
férricoEsteroides y Liebermann- +
triterpenos Burchard
Por medio del análisis fitoquímico preliminar fué posible evidenciar la presencia de
compuestos como: flavonoides, saponinas, esteroides, triterpenos, fenoles y
quinonas en el extracto etanólico de la parte aérea de Ardisia sp. Teniendo en
cuenta que por medio de los estudios químicos del género Ardisia se han aislado
saponinas, isocumarinas, quinonas y alquilfenoles5, los resultados del análisis
fitoquímico coinciden con lo reportado en la literatura.
3.3. Fraccionamiento
Por medio de un estudio cromatográfico preliminar se determinaron los solventes
adecuados para el fraccionamiento del extracto etanólico de parte aérea de Ardisia
sp. (EAPA). Teniendo en cuenta la polaridad de los compuestos presentes en el
extracto etanólico de hojas de Ardisia sp., se decidió realizar un fraccionamiento
sólido-líquido empleando cuatro solventes de polaridad creciente: éter de petróleo,
cloroformo, acetato de etilo y metanol.
Los sub-extractos obtenidos se secaron y pesaron para determinar el rendimiento
de extracción de acuerdo con la siguiente fórmula:
Peso del extracto obtenido
% = x 100
Peso del extracto Etanólico
Tabla 3: Resultados del fraccionamiento del extracto etanólico de parte aérea de Ardisia
sp.
Solvente Sigla Masa extracto %
(g) Rendimiento
Éter de EPAPA 8,40 16,07
petróleo
Cloroformo CAPA 0,50 0,97
Acetato de AEAPA 6,80 13,00
etilo
Metanol MAPA 35,6 68,09
Total 51,30 98,13%
El porcentaje de rendimiento indica la cantidad de compuestos solubles en cada
solvente de acuerdo a su polaridad. Los resultados 4 de la tabla 3, para el
fraccionamiento del extracto de parte aérea de la especie Ardisia sp., muestran
que la mayoría de los compuestos presentes en el extracto etanólico (68,09%)poseen un carácter polar de forma que fueron extraídos con metanol,
posiblemente por encontrarse en forma de glicósidos o por poseer pesos
moleculares muy altos. Los compuestos de carácter lipofílico que se solubilizaron
preferiblemente en éter de petróleo constituyen alrededor del 16% del extracto.
Cerca de un 14% son compuestos de polaridad media y fueron solubles en
cloroformo y acetato de etilo. Sin embargo la cantidad de compuestos solubles en
cloroformo es muy baja, solamente un 0,9% del total del extracto. Este método de
fraccionamiento permite separar adecuadamente grupos de compuestos de
acuerdo a su polaridad, sin someter el extracto a calentamiento, como ocurre en la
extracción sólido-líquido tipo soxhlet.
3.4. Evaluación de actividad antibacteriana
Se realizaron los ensayos preliminares de actividad antibacterial para los sub-
extractos de Ardisia sp., obtenidos por fraccionamiento sólido-líquido, con
solventes de polaridad creciente. En la siguiente tabla se relacionan los extractos
evaluados:
Tabla 4: Extractos para evaluación de actividad antibacteriana
Extracto Sigla Masa extracto
(mg)
Etanólico EAPA 30,2
Éter de EPAPA 29,0
petróleo
Cloroformo CAPA 30,9
Acetato de AEAPA 29,8
etilo
Metanol MAPA 30,1
Las cajas de Petri que contenían el agar Muller-Hilton, se impregnaron con la
solución bacteriana de concentración 1.5×106 UFC/mL. Posteriormente se
colocaron los sensidiscos que fueron a los cuales se les adicionaron 10 µl de
solución de extracto. A las 24 horas se tomaron medidas del halo de inhibición.
En la figura 6 se observa el ensayo de actividad antibacterial frente a
Staphylococus aereus. En los sensidiscos se encuentran los controles positivo (c+)
y negativo (c-) y los extractos etanólico (E1), etéreo (E2), clorofórmico (E3), de
acetato de etilo (E4) y metanólico (E5) de parte aérea de Ardisia sp. En la figura es
posible observar los halos de inhibición tanto del control positivo como losextractos E1, E3 y E4. Los halos fueron medidos de extremo a extremo del halo,
de tal forma que el halo del control negativo fue 0,6 cm la distancia.
Figura 6: halos de inhibición de los extractos E1 a E5 frente a S. aureus
En la figura 2 se observan los resultados del ensayo de actividad antibacterial para
los extractos etanólico (E1), etéreo (E2), cloroformo (E3), acetato de etilo (E4) y
metanol (E5), en donde se evidencian los halos de inhibición para los diferentes
extractos.
Figura 2: halos de inhibición de los extractos E1 a E5 frente a E. coli
Los halos obtenidos fueron promediados y con los promedios se calcularon los
porcentajes de inhibición. Los resultados se reportan en la siguiente tabla y se
pueden apreciar en la gráfica 1.Tabla 5: Resultados de actividad antibacteriana y % de inhibición
Cepa Sigla/ D promedio D C+ D C- %
bacteriana Número promedio promedio Inhibición
EAPA/1 1,37 1,50 0,60 85,6
Staphyloco
cus aereus
EPAPA/2 1,27 1,50 0,60 74,4
CAPA/3 1,45 1,25 0,60 130,8
AEAPA/4 1,70 1,25 0,60 169,2
MAPA/5 0,80 1,25 0,60 30,8
EAPA/1 1,30 1,40 0,60 87,5
Escherichia
EPAPA/2 0,80 1,40 0,60 25,0
CAPA/3 1,10 1,60 0,60 50,0
coli
AEAPA/4 1,77 1,60 0,60 117,0
MAPA/5 0,60 1,60 0,60 0,0
EAPA/1 1,10 1,60 0,60 50,0
Pseudomonas
auroginosa
EPAPA/2 1,00 1,60 0,60 40,0
CAPA/3 1,23 1,60 0,60 63,0
AEAPA/4 1,05 1,60 0,60 45,0
MAPA/5 0,60 1,60 0,60 0,0
Gráfica 1: Resultados de actividad antibacteriana y % de inhibición
180
160
140 S. aureus
E. coli
120 P. aeruginosa
100
% Inhibición
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5
ExtractoLos extractos de etanol, cloroformo y acetato de etilo de la especie Ardisia sp. mostraron actividad inhibitoria frente a Staphylococus aureus y E. coli. Los extractos de etanol, etéreo, cloroformo y acetato de etilo, presentaron actividad significativa frente a Pseudomonas aeruginosa. En la gráfica 1 se puede observar que los mayores porcentajes de inhibición se presentaron frente a Staphylococus aureus, los sub-extractos de cloroformo y acetato de etilo presentaron porcentajes de inhibición mayores al control positivo, 130,8% y 162,9% respectivamente, por tanto se deben determinar las CMI para estos dos extractos. Es posible observar que los compuestos responsables de la actividad del extracto total o etanólico se distribuyeron principalmente en los sub- extractos de cloroformo y acetato de etilo. Teniendo en cuenta que el porcentaje de inhibición para el extracto total fue menor (85,6%) que el de los sub-extractos CAPA y AEPA, es de esperar que algunos compuestos estén presentando un efecto antagonista en el extracto total. El extracto etanólico presentó actividad inhibitoria frente a E. coli, con un porcentaje de 87,5%. Los compuestos responsables de la actividad del extracto total o etanólico se distribuyeron en el sub-extracto de acetato de etilo, que presentó un porcentaje de inhibición de 117%. Los demás extractos no presentaron actividad inhibitoria, por lo que se recomienda continuar el estudio de CMI. Todos los extractos evaluados presentaron baja actividad o fueron inactivos frente Pseudomonas aeruginosa. Este es el primer reporte de actividad antibacterial para el género Ardisia.
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