ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN CONTROL DE CALIDAD: ASPECTOS RELEVANTES - MSc. María Salas Arruz Gerente General de Hypa6a S.A. Profesora Principal de ...
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ENSAYOS
MICROBIOLOGICOS
EN
CONTROL
DE
CALIDAD:
ASPECTOS
RELEVANTES
MSc.
María
Salas
Arruz
Gerente
General
de
Hypa6a
S.A.
Profesora
Principal
de
la
UPCH
ENSAYOS
MICROBIOLOGICOS
EN
CONTROL
DE
CALIDAD:
ASPECTOS
RELEVANTES
Temas:
• Ensayos
frecuentes:
Control
Microbiológico
(Limite
Microbiano),
Esterilidad,
Potencia
AnIbióIca,
Endotoxinas
Bacterianas
–
NormaIva
Fundamento
e
Interpretación
de
cada
ensayo.
• Manejo
de
Cepas
ATCC
• Cambios
recientes
en
USP
ó
BP
ó
en
las
BPL
de
la
OMS
para
ensayos
microbiológicos.
•
Infraestructura
requerida
para
reallizar
los
ensayos
microbiológicos
Areas,
Equipos,
personal-‐
Requerimientos
mínimos
para
implementar
los
ensayos
• Controles
ambientales
requeridos
en
las
áreas
microbiológicas
FUNDAMENTO E INTERPRETACIÓN : • Control Microbiológico (Limite Microbiano), • Esterilidad, • Potencia AnIbióIca, • Endotoxinas Bacterianas –
Fase Pre – analítica
Cepas
Control
Preparación
de medios y
diluyentes
Fase Analítica:
Promoción de
Crecimiento Validación
O Aptitud del
método de
prueba
Control Microbiológico o Limite Microbiano Objetivo: Permite determinar el número de bacterias mesófilas (aerobias) y hongos que pueden desarrollarse en una muestra así como determinar si en la misma se encuentran microorganismos de riesgo para la Salud (patógenos) como: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa , Salmonella yBacterias gram negativas tolerantes a la bilis
Control
Microbiológico
-‐
FUNDAMENTO:
Mediante medios de cultivos óptimos se evalúa si la
muestra tiene gérmenes dentro de los límites establecidos
y que éstos no sean patógenos.
Medio de cultivo óptimo: se encuentra libre de gérmenes y
aptos para que sean capaces de generar el crecimiento de
microorganismos si estos estuvieran presenten en la
muestra.(Control de medios - Pruebas de Promoción de
crecimiento)
Se prevee y evalúa si la ausencia de crecimiento en la
muestra corresponde a inactivantes que se encuentren en
la formulación.(Pruebas de aptitud)
Control Microbiológico o Limite Microbiano Medios de Cultivos: Se debe evaluar que esten libres de gémenes, para lo cual se les incuba por lo menos 48 horas y no debe presentar crecimiento alguno. Se debe evaluar que esten óptimos es decir que se compruebe que puedan crecer microorganismos si la muestra las tuviera, para lo cual se realiza la prueba de promoción de crecimiento
APTITUD DE LA PRUEBA - Validación
• Se
debe
establecer
la
apItud
del
método
es
decir
la
capacidad
de
la
prueba
para
detectar
los
microorganismos
previamente
inoculados
(en
canIdad
conocida)
en
presencia
del
producto
a
examinar.
• Permite
comprobar
que
el
método
sirve
para
el
fin
previsto
en
la
formulación
a
evaluar.
• Para
estas
pruebas
de
apItud
se
deben
uIlizar
suspensiones
estandarizadas
de
cepas
(ATCC:
American
Type
Culture
CollecIon)
Control Microbiológico -‐Partes El ensayo consta de 3 partes: A. Recuento Total de microorganismos aerobios. (microorganismos aerobios que requieren oxigeno para su desarrollo) TSA ( Tripticasa soya agar) B. Recuento total combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras. Sabouraud agar C. Determinación de patógenos. Se siembra la muestra en caldo TSB tripticas soya borth y luego pasa a medios diferenciales o selectivos.
Control
Microbiológico
-‐
Partes
C. Determinación de patógenos. Se siembra la muestra en
caldo TSB tripticas soya borth y luego pasa a medios
diferenciales o selectivos.
Manitol
salado
–Staphylococcus
aureus
Agar
Cetrimide
–Pseudomona
aeruginosa
1 g muestra en TSB Mac
Conkey
-‐
E.
Coli
10 g muestra en TSB Caldo
Rappaport
/
XLD
–Salmonella
sp
10 g muestra en TSB Caldo
Mosel/
VRD
Bacterias
gram
negaIvas
resistentes
a
la
bilis
InacIvantes • En alguno productos con posibles inacIvantes es necesario adicionar un neutralizante. Se requiere evaluar cual es el apropiado previo al ensayo • LeciIna ó Tween 80 • Hacer inoculo de menos de 100 ufc y la recuperación de ser de la mitad al doble (factor 2)
PRUEBA
DE
MICROORGANISMOS
ESPECÍFICOS
Pseudomona Staphylococcus
aeruginosa aureus
Escherichia Salmonella sp.
coliEspecificaciones – USP/BP
Expresión
de
resultados
Ensayo
Especificación
Resultado
CONTROL
MICROBIOLOGICO
102 UFC/g
(Máximo
• Recuento
microbiano
de
aceptable 200
aerobios
totales
UFC/g) Menor
de
10
UFC/g
10 1 UFC/g
(Máximo
• Recuento
combinado
de
de
aceptable 20
hongos
y
levaduras
UFC/g) Menor
de
10
UFC/g
• Determinación
de
patógenos:
Salmonella
sp
Ausente
en
1g
Ausente
en
1g
Pseudomona
aeruginosa
Ausente
en
1g
Ausente
en
1g
Staphylococcus
aureus
Ausente
en
1g
Ausente
en
1g
Escherichia
coli
Ausente
en
1g
Ausente
en
1g
Salmonella
sp
Ausente
en
10g
Ausente
en
10g
Dec
516-‐
Res
1482
Comunidad
Andina(Julio
2011)
-‐
CosméIcos
ÁREA DE APLICACIÓN Y
LÍMITES DE ACEPTABILIDAD
FASE ETARIA
Productos para uso en a. Recuento de microorganismos mesófilos
infantes (hasta 3 años) aerobios totales. Límite máximo 5 x 102 UFC/g ó
Productos para uso en ml.
área de ojos. b. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g ó
Productos que entran en ml.
contacto con las c. Ausencia de Staphylococcus aureus en
membranas mucosas. 1 g ó ml.
d. Ausencia de Escherichia coli en 1 g ó ml.
Demás productos a. Recuento de microorganismos mesófilos
cosméticos susceptibles aerobios totales. Límite máximo 5 x 103 UFC/g ó
de contaminación ml.
microbiológica. b. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g ó
ml.
c. Ausencia de Staphylococcus aureus en
1 g ó ml.
d. Ausencia de Escherichia coli en 1 g ó ml.
Productos a ser a. Ausencia de Candida albicans.
utilizados en los órganos
genitales externos TÉCNICAS
Y
ESPECIFICACIONES
(NormaIva)
ENSAYO
MEDICAMENTO
DISPÓSITIVOS
COSMÉTICOS
MÉDICOS
PRODUCTOS
SANITARIOS
CONTROL
USP,
BP
-‐-‐-‐
DECISIÓN
516
MICROBIOLÓGICO
EUROPEA
Técnicas
RESOLUCION
(ANTES
LÍMITE
OTRAS
Propias
1482
(JULIO
MICROBIANO)
2011
ESTERILIDAD
USP,
BP
USP,
BP
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
EUROPEA,
OTRAS
EUROPEA
OTRAS
ENDOTOXINAS
USP,
BP
USP
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
BACTERIANAS
EUROPEA
BP
OTRAS
OTRAS
POTENCIA
USP,
BP
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
ANTIBIÓTICA
EUROPEA
OTRAS
Esterilidad Consiste en evaluar si la muestra esta libre gérmenes viables. Esta prueba se realiza en medios de cultivo controlados y óptimos (TSB y THIO) También se evalúa la Aptitud de la prueba, es decir si la muestra no es capaz de inhibir el crecimiento (6 gérmenes)
Ensayo de Esterilidad/Inhibidores Para Antibióticos: Beta-lactamasa ó Penicinilasa PENASA es el nombre comercial, enzima que degrada la estructura de los anIbióIcos conocidos como b-‐lactámicos. Los anIbióIcos de este Ipo son hidrolizados por las b-‐ lactamasas, pierden su acIvidad anImicrobiana
Especificación
y
forma
de
expresión
de
resultados
doEnsayo
Especificación
Resulta
Esterilidad
Estéril
Estéril
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
Ausencia
de
crecimiento
microbiano
El
ensayo
no
se
debe
repeIr
si
se
verifica
que
no
se
ha
comeIdo
error
ó
contaminación
Valoración
microbiológica
(Potencia
anIbióIca)
• Se
compara
la
acIvidad
anImicrobiana
de
la
muestra
frente
a
un
estándar
de
concentración
conocida.
Potencia AnIbióIca . USP Método Cilindro placa Se emplean 15 placas, de manera que se obIene: S1= 9 lecturas S2= 9 lecturas S3= 45 lecturas S4= 9 lecturas S5= 9 lecturas M3= 9 lecturas
Valoración
microbiológica
(Potencia
AnIbióIca)
USP
BP
Emplea
curva
de
5
Emplea
2
curvas,
una
del
del
concentraciones
de
estándar
estándar
y
otra
de
la
muestra,
y
1
de
muestra
cada
una
de
3
concentraciones.
La
curva
debe
tener
como
………..
máximo
factor
de
dilución
1.25
Se
debe
realizar
3
Se
debe
realizar
2
repeIciones
repeIciones
independientes
independientes
En
ambos
casos
los
promedios
de
las
repeIciones
se
obIene
de
los
logaritmos
Diferencia
entre
USP
y
BP
Halo
Halo
USP BP
S3
S5
M3
S4 S2
S3 M3 M2
S1
S2
S1 M1
Log de Dosis
Log de DosisEndotoxinas Bacterianas • Son los pirógenos mas toxigénicos. • Es facIble cuanIficar la endotoxina mediante una técnica in vitro denominada LAL
Valoración
microbiológica
-‐especificación
y
expresión
de
resultados
Ensayo
Especificación
Resultados
Valoración
90.0%
-‐110.0%
de
lo
95.2
de
lo
declarado
Microbiológica
declarado
Los promedios de las repeticiones se obtiene de los
logaritmos
Ejm
Forma
errada
Forma
adecuada
Primer
Ensayo
97.00
%
Primer
Ensayo
1.986771734
(97)
Segundo
Ensayo
99.00
%
Segundo
Ensayo
1.995635195
(99)
Promedio
98,00%
Promedio
1,991203465
97.995%
¿QUE SON LAS ENDOTOXINAS
BACTERIANAS?
Son lipopolisacáridos que se encuentran en la
membrana externa de la pared celular de las
bacterias gram negativas, compuestos por un
polisacárido y el lípido A.
Inicialmente se les llamó endotoxinas ya que las
bacterias no la excretan al medio sino son
liberadas durante la lisis de la bacteria¿QUE ES LAL?
LAL (Limulus Amebocyte Lysate) o Lisado de
amebocitos del género Limulus, es un extracto
acuoso de amebocitos de la sangre de una
especie de cangrejo llamado Limulus
polyphemus ( Horseshoe Crab ), animal
prehistórico cuyo origen data del periodo
Cámbrico, de hace más de 500 millones de años,
por lo que se ha considerado como fósil
viviente encontrados en áreas costeras del este
de EE.UU y el Golfo de México.
Curso
de
Validación
de
Procesos
y
Técnicas
AnalíIcas,
dictado
por
HypaIa
para
IPEN-‐
2014
ETAPAS DE LA PRUEBA DE LAL
METODO GEL-CLOT
Confirmación de la Sensibilidad del reactivo de
LAL
Prueba de Factores de Interferencia (Inhibición
y magnificación)
Prueba del Límite de endotoxinaLA PRUEBA DE LIMULUS (GEL CLOT)
Fundamento:
• Las proteínas
coagulables del
lisado de
amebocitos de
Límulus gelifican
en presencia de
las endotoxinas
baterianas
FOTO: ASSOCIATES OF CAPE COD.PRUEBA DE LIMITE
Y CUANTIFICACIÓN
Ejemplo: Sensibilidad Etiquetada (lambda) 0.25 EU/mL
MVD = 64
DILUCIONES DE LA MUESTRA D.I.= Dilución inicial
Tubos D.I. 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Control
Negativo C.P.= Control positivo
1 + + + - - - - -
2 + + + - - - - -
C.P.1 + + + + + + + +
C.P.2 + + + + + + + +
Concentración de endotoxinas= λ x IE
λ = Sensibilidad del reactivo
IE= Inversa de la última dilución positiva
Concentración de endotoxinas = 0.25 x 4 = 1EU/mLPRUEBA
DE
INHIBICIÓN
Y
MAGNIFICACIÓN
Concentración
CSE
en
la
Solución
Concentración
CSE
en
Agua
LAL
Solució
de
Muestra
(UE/mL)
(UE/mL) n
de
Agua
Tubos Muestr
2
λ λ 0,5
λ 0,25
λ LAL 2
λ λ 0,5
λ 0,25
λ
a
(MDV)
1
+
+
+
+
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐
2
+
+
+
+
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐
3
+
+
+
+
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐
4
+
+
+
+
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐
-‐Especificación y forma de expresión Ensayo Especificación Resultado Endotoxinas No mayor de 10 Menor a 10UE/ Bacterianas UE/mg mg
MANEJO DE CEPAS ATCC
Cepas ATCC • Staphylococcus aureus ATCC 6538 • Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 • Escherichia coli ATCC 8739 • Salmonella typhimurium ATCC 14028 • Bacillus subtilis ATCC6633 • Candida albicans ATCC 10231 • Aspergillus brasiliensis ATCC 16404
TIPOS DE CEPAS - Cepas de colección: Microorganismos definidos por lo menos a nivel de género y especie, depositados y mantenidos en una Colección de Cultivos (CC) o Centro de Recursos Biológicos (BRC) y catalogados con el acrónimo de la colección/BRC seguido de un número identificativo. - En dicho catálogo se reseña el origen de la cepa, sus condiciones de cultivo y, en muchas ocasiones, algunas de sus características, así como la equivalencia, si la hay, con otras colecciones. Es equivalente a cepas de referencia, el proveedor más conocido es ATCC.
CEPAS - Cepas de reserva: cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia suministrada por el proveedor, o que proceden directamente del proveedor como tales. - Cepas de trabajo: subcultivos primarios obtenidos de una cepa de reserva. La USP indica que la cepa sólo debe ser utilizada hasta la quinta generación. - Cepas comerciales: cepas suministradas por casas comerciales diferentes de las colecciones de cultivo o Centros de Recursos Biológicos, y que pueden o no proceder de una colección de cultivos. - Cepas salvajes: No proceden de CC ni de BRC.
Solo es válido hasta el quinto pasaje
LIOFILO DE LA ATCC
Primer
Pasaje CEPAS
DE
RESERVA
Primer Primer
Primer Primer
Pasaje Primer Primer Pasaje
Pasaje Primer Primer Pasaje
Pasaje Pasaje Pasaje Pasaje
Segundo Pasaje
CEPAS
DE
TRABAJO
Segundo
Segundo Pasaje PasajeLas
cepas
se
uIlizan
en
Promoción de crecimiento de los
A
medios
Prueba de las propiedades B
inhibitorias de los medios
C
Prueba de las Propiedades
indicadoras de los medios
D
Ensayos de Aptitud del método de pruebaCaracterísticas
Medio de cultivo Microorganismo de prueba
C (-) C(+)
Agar VRB S.aureus E.coli Colonias rojas con precipitado
ATCC 6538 ATCC 8739 rojo al rededor
P.aeruginosa
ATCC 9027
Agar Mac Cokey S.aureus E.coli Colonias rojas o rosadas, que
ATCC 6538 ATCC 8739 puede tener precipitado al rededor
Agar Manitol Salado E.coli S.aureus Colonias amarillas con zona
ATCC 8739 ATCC 6538 amarilla al rededor
Agar Cetrimide S.aureus P.aeruginosa Colonias verdosas por formación
ATCC 6538 ATCC 9027 de piocianina
Agar XLD S.aureus Salmonella Colonias negras
ATCC 6538 ATCC 14028
C a l d o R a p p a p o r t S.aureus Salmonella Turbidez del medio. Se pone
Vasiliadis ATCC 6538 ATCC 14028 ligeramente amarillo
Caldo Mossel S.aureus E.coli El medio se enturbia
ATCC 6538 ATCC 8739
P.aeruginosa
ATCC 9027Infraestructura requerida para realizar los ensayos microbiológicos Areas, Equipos, personal-‐ Requerimientos mínimos para implementar los ensayos
Instrumentos necesarios
PERSONAL Los ensayos microbiológicos deben ser realizados y supervisados por una persona experimentada, calificada en microbiología o su equivalente. El personal debe tener entrenamiento básico en microbiología y experiencia prácIca relevante antes de ser autorizado a realizar el trabajo que implican los ensayos microbiológicos.
INSTALACIONES -‐ Microbiología Laboratorio de microbiología; Separado de áreas como las de producción Diseñada para sus acIvidades y evitar la contaminación y la contaminación cruzada Materiales de construcción para limpieza, desinfección y minimizar los riesgos de contaminación De acceso a personal autorizado
INSTALACIONES Personal del laboratorio debe conocer; Procedimientos de entrada y salida El uso de las áreas Las restricciones de trabajo en cada área Razón de las restricciones Niveles de contención
INSTALACIONES Sistemas de aire acondicionado; Separado de áreas como las de producción Incluir temperatura y humedad controlada El aire no debe ser fuente de contaminación
INSTALACIONES Clasificación de áreas ; De acuerdo a los productos y acIvidades a desarrollar El ensayo de esterilidad debe ser ejecutada en condiciones de operaciones de manufactura estéril/ asépIca Equipamiento; NO DEBE SER COMPARTIDO
AREAS
–IMPLEMENTACION:
Definir
hacer,
solo
para
lo
que
ha
espacio
suficiente
Control
Esterilidad
Potencia
LAL
Microbiológico
AnYbióYca
Preparación
de
X
X
X
…….
medios
Área
de
lavado
X
X
X
X
de
sucio
Área
de
lavado
X
X
X
x
de
limpio
Áreas
-‐-‐-‐-‐-‐-‐
x
…….
-‐-‐-‐-‐-‐-‐
clasificadas
Área
no
x
x
x
clasificada
Espacio
para
2
2
1
a
3
….,
Incubadoras
Validación de métodos de ensayo Los métodos de ensayo estándares (farmacopeicos) se consideran validados. Sin embargo, se necesita demostrar que el método de ensayo es adecuado para su uso en la recuperación de microorganismos en presencia del producto específico. Los métodos de ensayo que no se basan en las farmacopeas u otras referencias reconocidas deben ser validados antes de su uso. La validación debe incluir, cuando sea apropiado, determinación de la exactitud, precisión, especificidad, límite de de- tección, límite de cuantificación, linealidad y robustez. Los potenciales efectos inhibitorios de la muestra deben tomarse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestra. Los resultados deben evaluarse con métodos estadísticos apropiados,
Equipamiento Cada equipo, instrumento u otro dispositivo utilizado para el análisis, verificación y calibración debe identificarse individualmente. La validación inicial debe incluir estudios de desempeño (distribución espacial de la temperatura) para cada ciclo operativo y cada configuración de carga usada en la práctica. Se debe repetir este proce- so después de cualquier reparación o modificación significativa
ENSAYOS MICROBIOLOGICOS CABINA DE FLUJO LAMINAR HORIZONTAL
ENSAYOS MICROBIOLOGICOS Cabina de bioseguridad que permite el manejo de cepas y sustancias peligrosas como por ejemplo : citostáIcos
PRINCIPALES
EQUIPOS–IMPLEMENTACION:
Control
Esterilidad
Potencia
LAL
Microbiológico
AnYbióYca
Incubadoras
dedicadas
2
3
1-‐3
…….
Incubadora
común
1
1
1
para
medios
pH
metro
X
X
X
x
Cabina
de
flujo
X
x
laminar
ó
de
bioseguridad
Cabina
de
x
……
x
-‐-‐-‐-‐-‐-‐
bioseguridad
balanza
x
x
x
Autoclave
de
limpio
x
x
x
x
Autoclave
de
sucio
x
x
x
CAMBIOS
RELEVANTES
USP,
BP,
BPL
ENSAYO
USP
BP
CONTROL
………armonizada
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada
MICROBIOLÓGICO
ESTERILIDAD
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada
-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada
VALORACIÓN
Mayor
énfasis
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
MICROBIOLÓGICA
estadísIco
LAL
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada
-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada
EN
EL
2011
SE
PÚBLICA
BPL
DE
LA
OMS
ESPCÍFICA
PARA
MICROBIOLOGÍA
Buenas
pracIcas
de
la
OMS
para
laboratorios
de
microbiología
farmacéuIca
WHO
TRS
961.
2011
7. Instalaciones Los ensayos microbiológicos, si fueran realizados, deben ser conducidos en una unidad del laboratorio diseñada y construida apropiadamente. Para mayor orientación ver el proyecto del documento de trabajo Guía de la OMS sobre buenas prác4cas para laboratorios farmacéu4cos de microbiología (referencia QAS/09.297)
INSTALACIONES
• CONTROLES AMBIENTALES
CONTROLES AMBIENTALES • Los controles ambientales permiten evaluar la eficacia de las prácIcas de limpieza y desinfección realizadas y que podrían afectar la biocarga del ambiente. • Dichos controles deben darse cuando los materiales estén en la zona, se estén desarrollando las acIvidades de procesamiento y este presente el personal operaIvo.
MONITOREO AMBIENTAL Programa Monitoreo de aire Plaqueo Placas de contacto Temperatura Diferenciales de presión Limites de acción y de alerta Análisis de tendencias
LIMPIEZA, DESINFECCION E HIGIENE Programa Resultados del monitoreo ambiental Procedimientos en caso de derrame Lavado y desinfección de manos
INSTALACIONES
PARA
ENSAYO
DE
ESTERILIDAD
Area
clasificada
Control
y
registro
de
presión
posiIva
VesIdor
Especificaciones recomendadas por la
USP para controles del aire
Clases
de
Area
UFC/m3
de
aire
100
Menos
de
3
10
000
Menos
de
20
100
000
Menos
de
100
Especificaciones recomendadas por USP para
superficies de equipos o instalaciones
Clase
de
Area
UFC/placa
de
contacto
o
en
30
cm2
100
3
(incluido
el
piso)
10
000
10
(piso)
Especificaciones recomendadas por USP
para indumentaria del personal operativo
Clase
de
Guantes
VesYmenta
Área
(UFC/placa
de
(UFC/placa
de
contacto
)
contacto)
100
3
5
10
000
10
20
!Gracias por su atención! mariasalas@hypatia.com.pe
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