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CONTROL DE LA
BIOCONTAMINACIÓN EN
AMBIENTES CLASIFICADOS
Antonio Rodríguez Acosta
Facultativo Especialista Análisis Clínicos
Responsable de Calidad
Unidad de Producción Celular HRU Carlos Haya (Málaga)
COLABORADOR ASESORÍA TÉCNICA GRADOCELL
1. Iniciativa Andaluza de Terapias Avanzadas 2. Plan general de control ambiental 3. Métodos de muestreo
Impulsar el desarrollo y la traslación PROGRAMA ANDALUZ DE
clínica de nuevas terapias basadas NANOMEDICINA
en los resultados de los 3 programas
de investigación relacionados
con las terapias avanzadas
PROGRAMA ANDALUZ DE
TERAPIA CELULAR Y
MEDICINA REGENERATIVA
PROGRAMA ANDALUZ DE
GENÉTICA CLÍNICA Y
MEDICINA GENÓMICA
Laboratorios GMP Públicos de Terapia Celular en
ANDALUCÍA
UBICADOS EN CENTROS DE INVESTIGACIÓN:
CABIMER: acreditado.
LABORATORIO ANDALUZ DE REPROGRAMACIÓN CELULAR: en validación.
UBICADOS EN HOSPITALES:
Hospital Virgen de las Nieves: acreditado.
Hospital Reina Sofía: acreditado.
Hospital Carlos Haya : en validación.
UBICADOS EN BANCOS DE TEJIDOS:
Banco de Tejidos de Málaga: acreditado.
Banco de Tejidos de Granada: en validación.
Banco de Tejidos de Sevilla: en validación.
Banco de Tejidos de Córdoba: en validación.
Plan General de
Control Ambiental
5CONTROL DE LA BIOCONTAMINACIÓN
Plan general de actuación
• Medicamentos usados en terapia celular: “fabricación aséptica” (media-
fill):
– carga microbiana del ambiente de fabricación: clave para garantizar la
esterilidad de los productos fabricados.
• Biocontaminación: contaminación de materiales, equipos, superficies,
líquidos y gases con partículas viables.
• Control de la biocontaminación:
– establecer principios y metodología para controlar los niveles de
contaminación microbiológica.
– definir las medidas de control adecuadas para disminuir el riesgo de
contaminación.
6Plan general de actuación
Principales vías de entrada de microorganismos a las instalaciones:
– Personal:
• Partículas generadas por la descamación de la piel:
– personal de producción/control de calidad;
– operarios de mantenimiento de instalaciones;
FORMACIÓN
– personal implicado en la cualificación de equipos;
– operarios de limpieza.
• Comportamiento en el área clasificada
– Materiales:
• introducción de materiales y reactivos;
• introducción de equipos/instrumentos;
• actuaciones de mantenimiento en la instalación (sustitución de
elementos).
7Plan general de actuación
Procedimientos que pueden afectar al nivel de biocontaminación
– entrada de personal y vestuario;
– introducción de materiales;
– limpieza y desinfección de instalaciones y equipos;
– métodos de control microbiológico del área clasificada.
8Principios generales
Control microbiológico
– identificación de riesgos para el producto;
– probabilidad de que éstos ocurran;
– medidas de prevención y control;
– designación de las zonas de riesgo, determinación de los puntos y
procedimientos de muestreo;
– establecimiento de límites que aseguren el control microbiológico (niveles
de alerta y acción);
– medidas correctoras a realizar cuando se superen los niveles de alerta y
acción.
9Principios generales.
Durante la puesta a punto de la instalación (condición “en reposo”) se establecerá
un NIVEL BASAL DE CONTAMINACIÓN que posteriormente ha de ser monitorizado
“en funcionamiento” con el fin de detectar aumentos en los niveles de
contaminación.
Niveles de alerta y acción
– Nivel de “alerta”:
• ESTABLECIDO POR EL USUARIO;
• proporciona una alarma temprana ante el desvío de las condiciones
normales;
• implica un aumento de la atención sobre el proceso.
– Nivel de “acción”:
• (ESTABLECIDO POR EL USUARIO);
• requiere intervención inmediata;
• investigación de la causa;
• establecimiento de medidas correctoras. 10Metodología general control microbiológico
• Muestreo, incubación, recuento e identificación si procede de
partículas viables mediante:
– métodos adecuados;
– plan de muestreo preestablecido (puntos y frecuencia).
• Minimizar el riesgo de contaminación debido a los propios métodos de
muestreo.
• Preferible muestrear con la instalación “en funcionamiento” (equipos y
personal realizando operaciones habituales).
• No debe comprometerse de ninguna manera las operaciones de fabricación
ni poner en riesgo la calidad del producto.
• Las condiciones de muestreo (ej: número de operarios en la zona) deben
quedar registradas o trazadas.
11Frecuencia de muestreo
• Ha de estar previamente establecida (ej: semanal y mensual) y
revisarse según sea necesario en los siguientes casos:
– superación reiterada de los niveles de alerta o de acción;
– paradas prolongadas de las instalaciones;
– realización de trabajos de mantenimiento importantes en los sistemas
de ventilación;
– obtención de resultados inusuales;
– cambios en los procedimientos de limpieza o desinfección;
– acontecimientos inesperados que puedan favorecer la
biocontaminación.
12Identificación de las muestras
• Mantener la trazabilidad con la siguiente
información:
– punto de muestreo;
– fecha y hora;
– personal que realiza el muestreo;
– actividad realizada en la sala durante el
muestreo;
– lote y medio de cultivo usado;
– equipos utilizados para el muestreo e
incubación;
– desviaciones sobre el plan de muestreo.
13Procesamiento de muestras. Medios de cultivo.
• Medios de cultivo
según microorganismos esperados.
• Condiciones de incubación
• No selectivos:
– capaces de soportar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos;
– medios con base tripticasa de soja son ampliamente aceptados (TSA y TSB).
• Garantizar la calidad de los medios empleados:
– especificaciones;
– certificados de análisis.
• Demostrar crecimiento según condiciones de incubación establecidas en
cada Unidad:
– ensayos de promoción de crecimiento.
14Procesamiento de muestras. Condiciones de incubación.
Generalmente aceptados
– 2-5 días (30-35 ºC) bacterias;
cuando el número de
– 5-7 días (20-25 ºC) hongos y levaduras partículas viables es pequeño.
– Otras condiciones de incubación: siempre y cuando se demuestre que
proporcionan el ambiente adecuado para promover el crecimiento de los
microorganismos presentes en la instalación.
– Sospecha microorganismos con necesidades exigentes de crecimiento:
medios de cultivo, períodos y condiciones de incubación adecuados.
– Control de estufas: las condiciones de incubación han estar monitorizadas.
– Observación periódica de las placas durante la incubación.
15Recuento e Identificación de microorganismos aislados
• El nivel de caracterización dependerá de la criticidad del área clasificada:
– morfología celular mediante tinción de Gram (ej, áreas no críticas);
– identificación a nivel de género y especie (áreas críticas).
• Los identificaciones obtenidas pueden ayudar a:
– evaluar procesos de limpieza y desinfección implantados (aparición de
resistencias);
– identificar las posibles fuentes de contaminación.
• Si los resultados indican:
ACCIONES
– superación de los límites establecidos; CORRECTIVAS
– cambio en el estatus microbiológico de la instalación.
16Métodos de control
microbiológico
17Métodos de control microbiológico
• Niveles de control :
– aire:
• muestreo pasivo: sedimentación de partículas viables;
• muestreo activo: volumétrico de aire por impacto de partículas viables en
medios sólidos;
– superficies;
– (vestimenta);
– (líquidos).
18Sedimentación de partículas viables.
• Microorganismos en ambiente: transportados por partículas de diferentes
tamaños provenientes principalmente de:
» descamación de piel humana;
» aerosoles (saliva) ;
» polvo.
• El tamaño de partícula determina la velocidad de sedimentación (media
0.46 cm/s, puede variar entre 0.2 y 3 cm/s* )
• Medida de la sedimentación de partículas viables sobre las superficies
Valoración directa de la probabilidad de contaminación del producto.
*W. Whyte and NDS Bell, “The prediction of airborne contamination of 19
aseptically filled containers: a case study”Sedimentación de partículas viables.
• Límites de aceptación (Anexo I, NCF): GRADO Ufc /placa de 90 mm
diámetro.
ASedimentación de partículas viables.
• Relacionando el área y tiempo de exposición del producto y placas de
sedimentación se puede calcular la probabilidad de contaminación del
producto:
21Sedimentación de partículas viables.
• Ventajas:
– económico;
– monitorización de procesos: pueden colocarse muy próximas al área donde el
producto está expuesto;
– no interfiere con el flujo de aire de la zona (monitorización en CFL, grado A);
– riesgo bajo para la calidad del producto y la esterilidad del proceso;
– no es necesaria la participación de personal adicional.
• Inconvenientes:
– Debido a los bajos niveles de contaminación esperados, presenta poca
sensibilidad, a menos que los períodos de muestreo sean amplios.
22Muestreo volumétrico de aire
• Límites de aceptación (Anexo I, NCF): GRADO Ufc permitidas/m3
AMuestreo volumétrico de aire
• Volumen a muestrear: 1 m3.
• Tamaño recomendado de las placas usadas: 90 mm de diámetro (64 cm2).
• Corrección estadística de FELLER: a mayor cantidad de microorganismos,
mayor probabilidad de que penetren varios microorganismos por el mismo
orificio de la tapa y se solapen las ufc que aparecen tras incubación.
• Muestrear desde las zonas de mayor a las de menor grado.
• Aseptizar/esterilizar el cabezal antes de una jornada de muestreo.
24Control microbiológico de superficies
• Límites de aceptación (Anexo I, NCF): GRADO Ufc /placa 55 mm
AControl microbiológico de superficies
Muestreo con placas de contacto
• Se aplica un medio nutritivo sólido sobre una superficie de área conocida.
• Placas de 55 mm de diámetro (25 cm2) tipo RODAC (Replicate Organisms
Detection And Counting).
• Las ufc obtenidas son una imagen de los microorganismos presentes en el
área analizada.
• El medio nutritivo ha de estar en contacto con la superficie durante unos
segundos, ejerciendo una presión uniforme en toda la placa y en ausencia de
movimientos.
• Limpiar cuidadosamente con solución desinfectante (alcohol 70%) y toallita
estéril el área muestreada con el fin de eliminar los restos de medio de cultivo.
26Control microbiológico de superficies
Muestreo con hisopos
• Hisopos previamente humedecidos: muestreo de zonas irregulares o
inaccesibles a las placas de contacto.
• Se han de realizar trazadas paralelas por la superficie que se desea
analizar. Posteriormente se repite la operación en el mismo área y con el
mismo hisopo pero con trazadas perpendiculares a las anteriores. El
hisopo al mismo tiempo ha de rotarse.
• Posteriormente el hisopo se introduce en medio líquido y agita. Se realiza
una siembra e incubación de este medio líquido en placas de medio sólido.
27Principales fuentes de biocontaminación
Microorganismo Estado Principales fuentes de contaminación
Cocos gram + Partículas de descamación de la piel
Formas vegetativas.
(Micrococos) y aerosoles (tos).
Pelo, piel, heridas, abscesos, ropa y
Staphylococcus Formas vegetativas.
polvo.
Formas vegetativas. Aire, polvo, cartón, papel, agua y
Bacillus
Esporas ropa.
Hongos Formas vegetativas. Suelo, polvo, cartón y papel.
filamentosos Esporas
Levaduras Formas vegetativas. Pelo y piel.
28Conclusiones
• La función principal de la monitorización microbiológica es identificar
tendencias que sugieran una pérdida del control ambiental.
• Medidas para contener la contaminación:
– Entrenamiento y formación del personal.
– Evitar acceso de personal no autorizado.
– Mantener en adecuado estado las instalaciones (filtros, temperatura,
humedad, presiones).
– Correctas medidas de desinfección de materiales.
– Adecuado sistema de entrada y vestimenta del personal.
– Eficaz sistema de limpieza (personal entrenado y desinfectantes adecuados).
29Bibliografía
• ISO 14644: Cleanrooms and controlled environments:
– Part 1:Classsification of air cleanliness
– Part 2: Specifications for testing and monitoring
• ISO 14648: Cleanrooms and associated controlled environments. Biocontaminacion
control:
– Part 1: General principles and methods.
– Part 2: Evaluation and interpretation of biocontamination data.
• Guidelines on test methods for environmental monitoring for aseptic dispensing
facilities. Second edition.
• Garcia, Lynne S. (2010). Clinical Microbiology Procedures Handbook, Volumes 1-3 (3rd
Edition). American Society for Microbiology (ASM).
(http://www.knovel.com/web/portal/browse/display?_EXT_KNOVEL_DISPLAY_bookid=4194&VerticalID=0)
• WHYTE, W. In support of settle plates. PDA Journal of Pharmaceutical Science and
Technology, 50, pp. 201-204, 1996
• Evaluation of Irradiated Count-Tact 3P Performances bioMérieux Industry Culture
Media Group, Chemin de l’Orme, 69280 Marcy l’Etoile, France.
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