ANTIBACTERIANOS NATURALES QUE SUPRIMEN LA RESISTENCIA DE LAS BACTERIAS - SECRETARIA DE ESTADO EDUCACION SUPERIOR CIENCIA Y TECNOLOGIA ...
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ANTIBACTERIANOS NATURALES QUE
SUPRIMEN LA RESISTENCIA DE LAS
BACTERIAS
SECRETARIA DE ESTADO EDUCACION
SUPERIOR CIENCIA Y TECNOLOGIA
SEESCYT/IIBI
LOS RESULTADOS QUE SE PRESENTAN EN ESTE
TRABAJO PERTENECEN AL PROYECTO
FINANCIADO POR SEESCYT/IIBI MEDIANTE LA
CONVOCATORIA FONDOCYT 2005
“AISLAMIENTO Y ELUCIDACION
ESTRUCTURAL DE SUSTANCIAS
ANTIBIOTICAS Y FUNGICIDAS PRESENTES
EN PLANTAS MEDICINALES
DOMINICANAS, COMO POSIBLES
SUSTANCIAS ACTIVAS DE FARMACOS”
Estudios cromatograficos biodirigidos de
los extractos de Chiococa alba y
Securidaca virgata ponen de manifiesto la
existencia en estos extractos de una serie
de sustancias que poseen una marcada
actividad contra bacterias normales y
resistentes. Es bien conocido el hecho de
que generaciones de bacterias mutan su
fisiología presionadas por el constante y
no discriminado uso de antibióticos,
ocasionando la resistencia bacteriana.
natural.
El presente trabajo muestra el
procedimiento mediante el cual se
obtuvieron biocidas naturales de muy
buena pureza que suprimen la resistencia
bacteriana, cuyo análisis instrumental
permitió sugerir las estructura molecular
de por lo menos una de las sustancias,
proveyendo de esta forma la primera
etapa de la investigación del escalamiento
industrial de un fármaco
OBJETIVOS DEL PROYECTO
Aislar las sustancias activas
Elucidar la estructura molecular de
la sustancia objeto de la
investigación, lo cual sustenta la
razón del trabajo de investigación.
Medir la actividad la actividad frente
a cepas bacterianas resistentes
(objetivo no establecido inicialmente)
La diversidad de la flora de la isla
Hispaniola es una de las más
grandes de América, no ha sido
suficientemente estudiada ni
explotada como fuente potencial de
productos naturales.
La Fitogeografía de la hispaniola es de
aproximadamente 5600 especie, de las
cuales 1,800 plantas han sido identificadas
endémicas de la isla, lo que representa el
36% de su flora total.
La isla no posee familias endémicas pero
si más de 35 géneros. La densidad de
especies endémicas de la isla es de 0.064,
el cual es más alto que Cuba (0.052),
Australia (0.005) y Madagascar (0.010
TRABAJOS PRELIMINARES FUERON EL CRITERIO PARA ELEGIR LAS ESPECIES TRABAJADAS, LAS CUALES SE RECOLECTARON CON LA ASISTENCIA DE TECNICOS DEL JARDIN BOTÁNICO
MOLINO DE MARTILLO PARA PRODUCIR LA TEXTURA ADECUADA PARA EXTRACCION
EXTRACTORES SOXHLET PARA OBTENER LOS EXTRACTOS ROTAVAPORES PARA CONCENTRAR LOS EXTRACTOS
ENSAYOS PRELIMINARES DE LOS EXTRACTOS CRUDOS MUESTRAN MARCADA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
Actividad antimicrobiana de los extractos crudos etanólicos
frente a distintos microorganismos.
Microorganismos Medios C. alba S. virgata C. alba S. virgata
Tallo Raíz
Bacillus cereus TSA 1.45 1.10 0.95 1.30
Bacillus subtilis TSA * 0.60 - 0.65
S. aureus TSA 0.85 1.50 0.80 1.30
E. faecium TSA - - - -
L. mesenteriae TSA - - - -
S. arizona TSA - - - 1.15
K. pneumoniae TSA 1.35 1.25 0.95 1.25
L. monocytogenes TSA - - - -
P. aeruginosa TSA - - - -
Escherichia coli TSA 1.45 1.25 1.10 1.35
Candida albicans PDA - 1.95 - 1.90
Blanco (metanol) TSA - - - -
- Ausencia de halo de inhibición * Prueba no realizada
Fuente: Obtenido experimentalmente.LOS EXTRACTO CRUDOS SON CROMATOGRAFIADOS EN COLUMNAS LIQUIDAS
Actividad antimicrobiana de las fracciones Cromatográficas dentro de un
gradiente de polaridad
Fracciones (en Microorganismos
Hexano/Acetato
B. cereus S. aureus K. pneumoniae E. coli C.
de etilo) ** albicans
C. alba (tallo)
10% - - - - *
20% - - - - *
40% - - - - *
60% - - - - *
80% 0.80 1.00 - - *
100% 1.30 0.80 - - *
C. alba (raíz)
10% - - - - *
20% - - - - *
40% - - - - *
60% - - - - *
80% 1.00 1.00 - - *
100% 1.00 1.10 - - *Tamizaje molecular
Fracciones
Activas
C. alba (raíz) C. alba (tallo) S. virgata (raíz) S. virgata (tallo)
80 y 100 % 80 y 100 % 80 y 100 % 60 y 80 %
CCD
Hexano/Acetato de etilo
Tamizaje
MeOH/CHCl3
Pruebas
microbiológicas
S. aureus K. pneumoniae B. cereus C. albicans E. coliActividad antimicrobiana de las fracciones tamizadas
Molecularmente frente a distintos microorganismos.
Fracciones Microorganismos
B. cereus S. aureus K. pneumoniae E. coli C. albicans
C. alba (tallo)
F-1.1 - - - - -
F-1.2 - - - - -
F-1.3 0.80 1.00 - 0.80 -
F-1.4 1.00 1.20 - 1.20 -
F.1.5 1.80 1.10 0.80 1.20 -
C. alba (raíz)
F-2.1 - - - - -
F-2.2 - - - - -
F-2.3 - - - - -
F-2.4 - - - 0.85 -
F-2.5 - - - 0.80 -
F-2.6 0.90 0.80 - 1.00 -Separación cromatografica de Alta Resolución HPLC
Fracciones Activas
del Tamizaje
C. alba (tallo) C. alba (raíz) S. virgata (tallo) S. virgata (raíz)
F F F F F F F F F F F
1.3 1.4 1.5 2.4 2.5 2.6 3.3 3.4 3.5 4.5 4.6
HPLC HPLC HPLC HPLC
Mala separación Separación
de picos de picos
Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 Pico 5 Pico 6
CCD
Hexano/acetato de etilo
Pruebas
microbiológicasCromatogramas correspondientes a los picos P-3 y P-
4 que fueron activos microbiológicamente
Cromatograma del pico No. 3Espectro de Masa de la fracción P-4 pura activa
Espectro Infrarrojo de la fracción P-4 Espectro infrarrojo del componente bioactivo (P-4) Fuente: Obtenido experimentalmente Tesis.
Tabla de grupos funcionales orgánicos para espectro
infrarrojoPosible propuesta estructural de la molécula aislada
HO
CH3
H2C CH3
O
O
3-hidroxi, 2-metilen butanoato de metilo (C6H10O3 )Estructuras posibles de la fórmula molecular
C6H10O3 según MERCK INDEX
acetoacetato de etilo
delta lactona del ácido mevalónico
pantolactona anhídrido propiónicoRESISTENCIA BACTERIANA
Tres son los mecanismos básicos mediante los
cuales las bacterias son resistentes a los
antibióticos:
a) por inactivación del antibiótico;
b) por alteración del sitio blanco del antibiótico
c) por disminución del transporte del
antibiótico al interior de la célula.
Estos mecanismos pueden ocurrir
simultáneamente en un microorganismo.
Asimismo, puede manifestarse un solo
mecanismo para conferir resistencia a diferentes
clases de antibióticos INACTIVACION DEL ANTIBIOTICO
Hidrólisis enzimática Antibióticos -
lactámicos. Fueron los primeros
antimicrobianos que se introdujeron para
el tratamiento de infecciones comunes y
para los cuales se conoce con gran
precisión el mecanismo de la resistencia.
Asimismo, son los antibióticos de mayor
empleo y los más conocidos. Actúan inhibiendo las enzimas
D-alanil-D-alanincarboxipeptidasas
(también conocidas como
PBPS, proteínas que se unen a
penicilina), responsables de la
síntesis de la pared celular,
provocando filamentación y lisis
celular Los Beta-lactámicos, representados
por las penicilinas y cefalosporinas son
antibióticos efectivos contra bacterias
gram positivas y gram negativas. Las
enzimas responsables de proporcionar
resistencia contra estos antibióticos
son las Beta-lactamasas que hidrolizan
el enlace amida del anillo penicilánico o
cefalosporánico, produciendo derivados
ácidos, sin propiedades antibacterianasResultados de prueba de sensibilidad de los patrones de antibióticos frente a
microorganismos (resistentes). Halos expresados en milímetros (mm)
Patrones y Microorganismos
sus
concentraci E. coli E. cloacae K. pneumoniae
ones
T (30µg) * * *
AMK - 13 -
(30µg)
PEN * * *
(6µg)
CEF (30µg) 14 14 -
NORF (5µg) 22 23 12
AMX (10µg) - - -
Tetraciclina (T), Amikacina (AMK),
Penicilina (PEN), Amoxicilina (AMX),
Norfloxacina (NORF) y Ceftriaxona (CEF).
- Ausencia de inhibición * Prueba no realizada
Fuente: Obtenido experimentalmente .Resultados de pruebas microbiológicas de las muestras (picos)
obtenidos por HPLC frente a diferentes microorganismos. Halos
expresados en centímetros.
Microorganismos
Muestras
(picos) B. cereus S. aureus K. pneumoniae E. coli C. albicans
S. virgata
(raíz)
P-1 - - - - -
P-2 - - 1.6 - -
P-3 2.8 3.0 2.2 2.1 4.6
P-4 3.8 5.4 3.8 5.2 5.8
P-5 - - - - -
P-6 - - - - -Gráfico de la CMI de P-4 frente a
microorganismos resistentes a antibióticos
Concentración Mínima Inhibitoria del compuesto aislado frente a
bacterias resistentes.
40
S . a ure us
35
35
30
E . c o li
Halos de inhibición
25 23
K. pne um o nia e 22
21
20
E . c lo a c a e 18
16
15 15 15
14
13
12 12
11
10 10
5
1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
F-1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8
(0.488 (0.122 (0.0305 (0.0200 (0.0150 (0.0075 (0.00375 (0.00187 (0.00075
mg/μL) mg/μL) mg/μL) mg/μL) mg/μL) mg/μL) mg/μL) mg/μL) mg/μL)
Diluciones del compuesto aislado
Fuente: Obtenido experimentalmenteResultados de la CMI de las fracciones aisladas
frente a microorganismos resistentes a
antibióticos. Halos expresados en milímetros
(mm).
Diluciones de las fracciones aisladas Microorganismos
S. aureus E. coli E. cloacae K. pneumoniae
P-4 (0.488 mg/μL) 35 23 16 21
1.1 (0.122 mg/μL) 22 18 15 18
1.2 (0.0305 mg/μL) - 15 15 15
1.3 (0.0200 mg/μL) - 12 14 13
1.4 (0.0150 mg/μL) - 12 12 -
1.5 (0.0075 mg/μL) - 11 11 -
1.6 (0.00375 mg/μL) - - 10 -
1.7 (0.00187 mg/μL) - - - -
1.8 (0.00075 mg/μL) - - - -
Blanco - - - -EQUIPO DE COLABORADORES Ing. Susana De Jesús, MSc. Lic.Miguel Caldentey Lic. Adrián Gutiérrez Lic. Ricardo Abreu
GRACIAS
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