Proceso continuo con reciclo: cultivos de alta densidad celular

Proceso continuo con reciclo: cultivos de alta densidad celular
 María Cristina Rubio* y Antonieta Gordillo

 Instituto de Biotecnología. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia.
 Universidad Nacional de Tucumán. 4000. Tucumán. Argentina.

 m1rubio25@hotmail.com; maria.rubio@fbqf.unt.edu.ar

Resumen
Una de las áreas de investigación más importantes de la biotecnología es la ingeniería genética y
productos de valor agregado. Para que un producto sea competitivo económicamente es necesario
desarrollar procesos que permitan altas concentraciones celulares; evitar la inhibición por sustrato y
reducir aquellas debida al producto. El diseño de sistemas de fermentación que permiten una elevada
productividad y alta concentración celular es utilizando un proceso continuo con reciclo o
recirculación celular. El objetivo de este trabajo es efectuar una revisión de los cultivos de alta
densidad celular, el funcionamiento del proceso continuo con reciclo y las investigaciones en las
diferentes áreas de la biotecnología, a fin de concientizar su aplicación a nivel industrial.

Palabras clave: Alta densidad celular; proceso fermentativo; reciclo; recirculación de células.

Abstract
One of the most important areas of biotechnology research is genetic engineering and high-speed
production processes, in order to obtain high volumetric productivity in value-added products. For a
product to be economically competitive it is necessary to develop processes that allow high cellular
concentrations; avoid substrate inhibition and reduce those due to the product. The design of
fermentation systems that allow high productivity and high cellular concentration is using a continuous
process with cell recycle or recirculation. The objective of this work is to carry out a review of high cell
density crops, the functioning of the continuous process with recycling and research in the different
areas of biotechnology, in order to raise awareness of their application at the industrial level.

Key words: High cellular density; fermentation process; recycle; cell recirculation.

Introducción en cuenta para la selección y formas de
 operación se basan en las siguientes
 Los procesos fermentativos se dificultades: • Retener a los microorganismos
realizan en bioreactores que pueden operar en el interior del reactor. • Reutilizar las
en forma discontinua; semicontinua o células. • Mantener la actividad de los
continua, los cuales utilizan diferentes microorganismos durante largos periodos de
sistemas de cultivos, sea en superficie o operación. • Evitar la formación de espumas •
sumergidos. Dentro de estos procesos se Controlar el proceso global mediante los
pueden utilizar células libres o inmovilizadas fenómenos de transferencia. • Disminuir los
para las reacciones de transformación efectos electrostáticos.
química, la cual es un área de gran interés En un reactor que opera en
debido a sus grandes posibilidades discontinuo, la productividad volumétrica
industriales (Moreno García et al., 2018; (masa de producto/vol. x tiempo) del sistema
Hutchinson et al., 2019). Los bioreactores es mucho menor respecto a los reactores de
pueden ser columnas de relleno, provistos de procesos continuos. Las ventajas que tienen
sistemas de agitación, de lecho fijo o reactores los procesos convencionales, es que la
de lecho fluidizado. Los criterios que se toman inversión y la complejidad del sistema es

BioTecnología, Año 2021, Vol. 25 No.2 47

menor (Martos, 2011; Barba & Clausell Terol, de los sustratos (Wright et al., 2014; Jamilis,
2014; Lindskog, 2017; Nieto Taype et al., 2016; Lindskog, 2017).
2020). Una de las áreas más importantes de El objetivo de este trabajo es efectuar
la biotecnología por sus potenciales una revisión de los cultivos de alta densidad
descubrimientos son la ingeniería genética y celular, el funcionamiento del proceso
reactores con elevada velocidad de continuo con reciclo y las investigaciones en
producción. Por ello, a fin de obtener las diferentes áreas de la biotecnología, a fin
condiciones de trabajo óptimas para los de concientizar su aplicación a nivel industrial.
microorganismos se han estudiado e
investigado nuevos sistemas de fermentación, Reactores continuos de tanque agitado
con los cuales se pueda obtener altas con recirculación celular
productividades. Debido que este parámetro
es directamente proporcional a la El desarrollo creciente y acelerado de
concentración de células, es sustancial la economía moderna, impone nuevos retos a
trabajar con cultivos de alta densidad celular los países solicitando competitividad e
(Westman & Franzén, 2015; Santos et al., implementación de tecnologías de alta
2016; Moreno García et al., 2018; Véliz eficiencia que permitan reducir costos e
Valenzuela, 2020; Malairvang et al., 2020). incrementar la productividad de los procesos.
 La necesidad de obtener procesos Dentro de los métodos empleados
competitivos a nivel económico y productivo frecuentemente, el reciclo o recirculación de
llevó, en primer lugar, a utilizar sustratos células es seleccionado con respecto al
económicos, provenientes del descarte de las proceso fed batch o lote alimentado y al uso
industrias. Así, Los estudios realizados por de células inmovilizadas, debido que ambos
Santos et al. (2016) alcanzaron altas presentan elevado costo para el control del
productividades usando procesos con reciclo proceso y dificultades para mantener las
y alta densidad celular, en el cual S. stipitis condiciones de operación, especialmente en
pudo adaptarse a medios ricos en xilosa la inmovilización, se plantean problemas de
(residuos agroindustriales) para la producción transferencia de oxígeno adecuadas para la
de etanol. A su vez, Matana et al. (2013), Kang actividad celular (Martos, 2011; Barba &
et al. (2015) y Silva et al. (2016) reportaron el Clausell Terol, 2014; Hutchinson et al., 2019).
uso de sustratos celulósicos y lignocelulósicos Las industrias de bioprocesos que
para la producción de etanol. En segundo operan en continuo son: la producción de
lugar, operar con procesos de alta densidad etanol, levadura de panificación y algunas
celular. Cabe resaltar, que estos sistemas reacciones de conversión de sustrato a
presentan complicaciones adicionales como: producto mediante sistemas enzimáticos
acumulación de productos y residuos que (Westman & Franzén, 2015; Lindskog et al,
pueden inhibir la producción, elevadas 2017; Malairvang et al., 2020). En un reactor
demandas de oxígeno y sustratos, aumentos homogéneo y agitado, la corriente de medio o
en la densidad y viscosidad del medio, por ser flujo de salida tiene la misma composición que
altamente concentrados (Tao, 2011; el medio que se encuentra en el reactor. Estos
Lindskog, 2017; Malairvang et al., 2020). se conocen como reactores de mezcla
Durante los últimos 30 años se han perfecta mediante las siglas CSTR
desarrollado numerosos algoritmos de (continuous stirred-tank reactor), es decir
estimación y control para bioprocesos, siendo reactor de tanque agitado continuo (Barba &
una referencia los aportes realizados por Clausell Terol, 2014; Kang et al., 2015;
Bastin & Douchain (1990). Sin embargo, el Jamilis, 2016; Lindskog et al., 2017; Nieto
desarrollo de algoritmos específicos para Taype, 2020).
procesos de alta densidad, con las En un proceso continuo, donde la
restricciones que estos implican, es aún poco velocidad del flujo de alimentación (FS0) y la
explorado. Es de interés el desarrollo de este de salida del reactor son iguales (FSrX),
tipo de controles para su aplicación en la continuos y constantes, la productividad del
producción de bioplásticos, biogases y otros sistema se calcula como se indica en la
procesos similares donde los puntos de ecuación 1:
operación óptimos no son conocidos con
exactitud debido a la incertidumbre existente -=-[ ]-D (1) 
respecto a la biota del proceso y la impureza

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Donde P, es la concentración de velocidad de conversión de sustrato a
producto (g/L) y D (h-1), la velocidad de producto y con la recirculación o reciclo celular
dilución, que se ajusta variando el caudal y se se trabaja con altas velocidades de dilución, lo
calcula midiendo el flujo (L/h) por unidad de que permite mayor flexibilidad de operación
volumen de trabajo (V) del reactor (L). Cuando (Barba & Clausell Terol, 2014; lindskog, 2017;
el sistema continuo llega al estado Malairvang et al., 2020).
estacionario, en el cual las variables son
independientes del tiempo, la velocidad En 1961, Herbert fue el primero que
específica de crecimiento (µ) es igual a reportó el diseñó del proceso continuo con
velocidad de dilución (µ=D). Esto significa que reciclo. Posteriormente se estudiaron varias
si aumenta D, incrementa µ y por lo tanto la formas de recircular células en los procesos
productividad, de acuerdo a la ecuación 1. La de fermentación, ellas son: recirculación
limitación del proceso continuo convencional, externa de la biomasa y recirculación interna
es que la velocidad de dilución (D) no se puede de células, también llamado cultivo de
aumentar indefinidamente, ya que la velocidad perfusión (Pérez et al., 2004; Wright et al.,
especifica de crecimiento máxima no logra 2014; Bohorquéz rincón & Sarmiento Higuera,
alcanzar al valor de D y se produce el lavado 2017; Véliz Valenzuela, 2020). Pérez et al.
del reactor, es decir en el flujo de salida se (2004) reportaron que el equipo de separación
incrementa el número de microorganismos y la se encuentra en el interior del reactor, las
concentración de sustrato limitante llega a células están físicamente retenidas mediante
tener el mismo valor que el sustrato de entrada un dispositivo mecánico, por ejemplo un filtro,
(S0) (Martos, 2011; Kang et al., 2015; Nieto por lo cual el medio libre de células se obtiene
Taype et al., 2020). desde el interior del filtro. De esta forma, se
 Los procesos de alta densidad celular alcanza eficiencia en el proceso sin que se
son aquellos en los cuales la concentración de elimine continuamente o se produzca la
microorganismos supera los 50 a 100 g/L. Los dilución de células. En este caso se pueden
bioprocesos de baja densidad celular utilizan lograr concentraciones superiores a 107
concentraciones menores, siendo muy células/mL. Debido que en este sistema el
usados para los estudios de investigación filtro se encuentra inmerso en el medio y no
(Jamilis et al., 2014; Salar García, 2017; tiene movimiento, el inconveniente que se
Herrera et al., 2019). En general se emplean genera en el bioreactor es el bloqueo o
para el modelado de procesos microbianos, taponamiento del filtro por las células que
formulación de medios de cultivo, estudio de rodean al equipo. Las investigaciones de
factores externos sobre el desarrollo de Hernández et al. (2010) reportaron que en el
procesos celulares, etc. (Jamilis, 2016; Ortega cultivo de perfusión de células de mamíferos,
Quintana et al., 2017, Nieto Taype et al., en tanque agitado, el dispositivo de retención
2020). La desventaja de estos procesos es la celular es un filtro rotatorio o spinfilter. Con
baja productividad, y los grandes volúmenes este sistema se logró alcanzar altas
de medio que se deben procesar luego de la densidades de células en el seno del
fermentación. Las condiciones de alta fermentador, trabajar a velocidades de
densidad celular sirven para incrementar la dilución elevadas, utilizar instalaciones de
productividad volumétrica, es decir, para pequeña capacidad y obtener altas
obtener mayor cantidad de biomasa o concentraciones de producto en menor
producto en un determinado volumen y tiempo tiempo, sin que se produzcan obstrucciones
(Matana et al., 2013; Tapia et al., 2013; en el filtro. En ambos casos de recirculación
Malairvang et al., 2020). Además, las se requiere de un equipo de separación
elevadas concentraciones de biomasa que se sólido-líquido por un proceso de
pretende alcanzar se corresponden con una sedimentación, centrifugación o filtración
gran cantidad de sustrato que se debe (Barba & Clausell Terol, 2014; Westman &
consumir a lo largo del proceso. Franzén, 2015; Lindskog, 2017).
 El uso de un sistema de reciclo de En la Figura 1 se muestra un esquema
microorganismos en un fermentador permite del proceso continuo con reciclo externo de
incrementar la concentración de células. De células. Este sistema consta de un recipiente
esta manera, con un aumento del catalizador que contiene al sustrato (S0), un reactor y un
biológico en el reactor se obtiene mayor separador externo de células (Se). Es un

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sistema agitado que mantiene la Dónde: F, es velocidad de flujo de
homogeneidad en el interior del reactor. El entrada al bioreactor; F (1+α), velocidad de
medio de cultivo que tiene el sustrato (S0) flujo de salida; αF, velocidad de flujo de
ingresa al fermentador por medio de una recirculación desde el separador al reactor y
bomba a una velocidad de flujo (F), expresado α, es la relación de reciclo, llamado también
en volumen/ tiempo (L/h) y sale del bioreactor, razón volumétrica de recirculación, que tiene
a la misma velocidad, con un flujo de valores entre 0 >α < 1.
F(α+1)X1. Si se realiza el balance de células del
 Donde S0, concentración de sustrato reactor (Fig.1) y se expresa en forma
inicial; F, flujo volumétrico de alimentación; X1, matemática, se tienen las ecuaciones 4 y 5.
concentración de células en un volumen (V)
del reactor; µ, velocidad específica de
crecimiento; X2, concentración de células a la ó + é 
salida del separador (Se). − é = ó 
 é (4)
 Si se realiza un Balance de flujo del
sistema (Fig. 1) y se expresa en forma
matemática se obtienen las ecuaciones 2 y 3. 1 + 1 − (1 + ) 1 = 
 
 (5)
 
 = ------ Donde intervienen los términos,
 - (2) velocidad especifica de crecimiento (µ); masa
 celular (X); factor de concentración de células
 (C), cuyo valor debe ser mayor a 1 (C > 1),
 + = (1 + ) (3) acumulación o variación de células un
 intervalo de tiempo (dX/dt) y volumen (V) de
 líquido en el reactor. En la ecuación 5, no se
 Reordenando la ecuación 3, se
 incluyeron los términos, FX0, debido que el
demuestra que:
 medio de cultivo es estéril, y la velocidad de
 muerte de células (α X1V) se desprecia al
 (1 + ) = (1 + ) tener un valor menor frente a la masa celular
 activa del sistema.

 Figura 1: Esquema de un proceso continuo con recirculación de células.

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Si se asume las mismas 1 + 2 = (1 + ) 1 (8)
consideraciones que para un balance del
proceso continuo convencional, en el estado
estacionario, la variación de dX/dt=0. Este Se reordenan los términos comunes de los
valor se reemplaza en la ecuación 5, se divide miembros y se obtiene la ecuación 9
por V, se reordenan los términos y la ecuación
queda:
 2
 2 = 1 (1 + − ) ó = (1 + − ) (9)
 1
 1 (1 + ) 1 1
 = −
 
 Esta ecuación demuestra que X2 <
 X1, ya que el valor de X1 está multiplicado por
 Donde la relación F/V= D, siendo D, la relación de reciclo y el factor de
velocidad de dilución cuya unidad es h-1. Se concentración.
reemplaza D, se simplifican los términos, X y
D y se obtiene la ecuación 6: Considerando, que la relación de la
 velocidad especifica de crecimiento y la
 velocidad de dilución también es igual a los
 = (1 + − ) (6) factores (ecuación 6), se pueden relacionar
 las variables ( ) por la ecuación 10.

 = (1 + − ) (6)
 2 
 = (10)
 1 
 De esta ecuación se concluye que
µ< D a diferencia del continuo convencional
donde µ=D. El valor de D está incrementado Por medio de esta ecuación se
por la relación de reciclo y el factor de determina el valor de cualquiera de las
concentración celular. variables conociendo el valor de las otras.
 Con la ecuación 6 se puede demostrar En el proceso continuo con reciclo, las
el resultado del sistema cuando α=1 y C=1 o células vuelven al reactor como se muestra en
al variar el valor de ellos. A modo de ejemplo la figura 1. Debido a esto, la concentración
se tiene: celular del reactor se puede controlar a través
 del caudal de purga de salida del equipo de
1. Si α=1 y C= 2, se tiene que,µ= 0, lo que separación. Previamente, la corriente de
 indica que no hay crecimiento celular.
 salida del flujo pasa por un equipo de
2. Si α=0.5 y C=1, se obtiene que µ= D, no
 separación, por ejemplo una centrífuga,
 es un proceso con recirculación o reciclo
 sedimentador o filtro. La centrifugación es un
 celular.
 proceso óptimo para separar organismos
3. Si α= 0.5 y C=2.5, por lo tanto µ= D (0.25)
 indica que hay reciclo celular. unicelulares pero tiene la desventaja de
 facilitar la contaminación de las células que
 A nivel del separador (Se), también se regresan al bioreactor y un elevado gasto
puede realizar un balance de las células que energético (Pérez et al., 2004; Lindskog,
ingresan y salen del equipo como se muestra 2017). Los sedimentadores son económicos
en las ecuaciones 7 y 8: pero requieren mucho tiempo para la
 separación y decantación de las células. La
 filtración tangencial es uno de los métodos
 más prometedores. En este filtro, la dirección
 é = é 
 del flujo es paralela a la superficie del medio
 (7)
 filtrante. Por lo cual, la velocidad del medio
 que ingresa impulsa a las células hacia la
 salida. Mientras que el medio líquido (filtrado)

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Figura 2: Mecanismo de filtración tangencial. Esquema de un tubo de membrana del filtro.

sale en forma perpendicular a través de la Las exigencias para el uso de las
membrana del filtro debido a la presión del membranas filtrantes son: 1- eficacia de
fluido (Figura 2), obteniéndose un flujo del separación mediante una porosidad regular y
filtrado que sale del filtro tangencial. El filtrado conocida; 2-elevado rendimiento de
se recoge por conductos diferentes a las permeación y 3- elevada resistencia térmica,
células, las cuales van acompañadas por una química y mecánica.
fracción de medio de cultivo agotado (Shen,
 Actualmente se utiliza mucho la
2014; Bohorquéz Rincón & Sarmiento
 filtración tangencial con membranas de
Higuera, 2017).
 cerámica para el filtrado de vinos (Pérez de
 Los filtros tangenciales permiten tiempos Alarcón, 2018).
prolongados de operación, facilitan el retorno de
los microorganismos al reactor en condiciones de Aplicaciones
asepsia y permiten la limpieza in situ.
 Una aplicación importante es en el
 Los filtros pueden tener diferentes área industrial, donde el reciclo de los
tipos de membranas como las de organismos permiten la adaptación y la
microfiltración (con poros de 1 a 10 µm); de degradación de sustratos celulósicos para la
ultrafiltración (poros entre 0.001 a 0.05 µm) y producción de un metabolito de alto valor
membranas de osmosis reversa de 0.5 a 1nm. agregado como el etanol (Matana et al., 2013;
Estas últimas son usadas para retener sales Kang et al., 2015; Silva et al., 2016). También
para la purificación de aguas (Bohorquéz este sistema disminuye el efecto Crabtree,
Rincón & Sarmiento Higuera, 2017). importante en la producción de biomasa para
 Para este fin, existen dos tipos de el área alimentaria (Malairvang et al., 2020). El
membranas: anisotrópicas e isotrópicas. Esta inconveniente del uso de sustratos
última tiene poros uniformes por lo cual pueden agroindustriales es que contienen partículas
retener partículas o células en el seno de su en suspensión, siendo una posible solución
estructura que llegan a deteriorarse por realizar un prefiltrado para eliminar en
contaminación microbiana. Las membranas condiciones aerobias o anaerobias, el cual
anisotrópicas poseen dos estructuras diferentes, permite aumentar la velocidad de degradación
una muy delgada (menos de 1 µm) de alta del contaminante y la estabilidad del sistema.
selectividad y otra de un grosor de 20 µm a Así, en el área de medioambiente, se ha
1mm, siendo una estructura más abierta. Estas reportado el aislamiento de Dehalococcide
membranas no permiten el pasaje de ninguna mccartyi, capaz de reducir el percloroeteno y
partícula ni célula al interior de estas, por lo cual
 tricloroeteno a eteno, el cual fue considerado
son fáciles de remover de la superficie
 como un organismo clave para biorremediar
(Bohorquéz Rincón & Sarmiento Higuera, 2017).
 sitios contaminados con estos compuestos
 Las membranas pueden ser (Wright et al, 2014). Una desventaja que se
fabricadas con distintos materiales como, presenta en este sistema es que con el
celulosa; nylon; polietileno; metal y cerámica. producción de otros productos de interés. Es

BioTecnología, Año 2021, Vol. 25 No.2 52

decir que se puede trabajar con células Barba A & Clausell Terol C (2014) Reactores
mutantes o recombinantes, ya que dentro del Químicos y Bioquímicos. Edt. Universitat
reactor, al aumentar el número de células se Jaume
restringe el espacio organismos desarrollarán
más lentamente y mayor será el tiempo en el Bohorquéz Rincón C & Sarmiento Higuera D
cual se pierde la información genética. En (2017) Análisis del uso de bioreactores de
base a esto, en el área de ingeniería genética, membrana para el tratamiento de aguas
se reportaron investigaciones para obtener residuales y posible implementación en
altos niveles de expresión de proteínas Colombia. Tesis de grado. Facultad de
recombinantes y en el desarrollo de virus para Ingeniería. Universidad Católica de
producir vacunas en el área de veterinaria Colombia.
(García et al., 2013; Tapia et al., 2016; Salar
 García J, Santaio Z, Zomalocarregui L,
García, 2017; Ravasi, 2016; Véliz Valenzuela,
 Quintana M, González D, Furrazola G, Cruz
2020). Otra desventaja del reciclo, es que al
 D (2013) Estrategias de obtención de
incrementar el número de células, dificulta la
 proteínas recombinantes en Escherichia
transferencia de oxígeno en el medio cuando
se realizan fermentaciones aerobias. coli. Vacci Monito 22: 30-39.
Aprovechando este inconveniente, el sistema Herbert D (1961) Continuous culture of
puede ser aplicado a células vegetales o microorganisms. Edt. Soc. Chem. Ind.
animales debido al menor consumo de Monog. 12 London, pp. 21.
oxígeno por las células (Smelko et al., 2011).
 Hernández M, González A, Bouza J, Mayo O,
 Los estudios en investigación
 Kulich E, Riera G (2010) Modelación
aplicada no solamente se recirculan las
 preliminar de cultivo en perfusión de células
células sino también fuentes de nitrógeno,
 de mamíferos en tanque agitado con
fósforo o algún nutriente indispensable para el
 spinfilter como dispositivo de retención.
desarrollo celular o producción de un
 Biotecnol. Apl. 27: 36-41.
metabolito (Pérez et al., 2004; Matana et al.,
2013; Santos et al., 2016; Lindskog, 2017). Si Herrera J, Leon L, Torres Y, Canon N, Herrera
el sustrato en un gas (CO2; CH4) se recicla y A, Cuenca M (2019) Evaluación y selección
se usa como fuente de carbono (Martos, 2011; de 23-29.
Barba& Clausell Terol, 2014; Lindskog, 2017;
Malairvang et al., 2020). Hutchinson U, Seneto K, Boredi S, Ngongang
 M, du Plessis H, Booyse M, Jolly N (2019)
Conclusiones Reusability of immobilized cells for
 subsequent balsamic – styled vinegar
 Los sistemas continuos con reciclo
 fermentations. Ferment. 6: 1-3 (doi:
son una alternativa para ser aplicados en la
 10.3390/fermentation6040103).
industria a fin de mejorar la velocidad de
producción de un metabolito de valor Jamilis M, Garelli F, Salatul M, Mozumder I,
agregado, disminuir el tiempo de formación Castañeda T, De Battista H (2014).
del mismo; trabajar con velocidades de Modeling and estimation of production rate
dilución mayores a la velocidad especifica de for the production phase of non-growth-
crecimiento máxima del organismo y associated high cell density processes.
aumentar la productividad del sistema. Las Biopr.. Biosy. Eng. 38:1903-1914.
desventajas del sistema pueden ser utilizadas
para la obtención de productos de células Jamilis M (2016) Modelización, monitoreo y
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